蛋白质结构解析ppt课件.ppt

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1、第二章第二节蛋白质结构解析蛋白质的氨基酸序列分析生物质谱X-射线晶体衍射技术核磁共振技术主要内容一、蛋白质和多肽的氨基酸序列分析Synopsis:1.Apracticalapproachtodeterminingaminoacidsequencerequiresamethodtoremoveoneaminoacidatatimefromapolypeptidechain.2.Thisisachievedbytheuseofphenylisothiocyanate（异硫氰酸苯酯）astheN-terminallabelingrea

2、gent,theEdmanmethod(亦称PTC法或PTH法).3.Thistechniquecanonlydealwithchainsof20to60aminoacids,andmostproteinsaremuchlarger.4.Tocompletetheprocess,selectivehydrolysisofthepolypeptidechaincutsverylongpolypeptidesintospecificfragmentsofmoremanageablesize.1.N端序列分析Sangerwasthefi

3、rstpersontodetermineaproteinsequence,forinsulinin1953.Theproblem:afterlabellingtheN-terminalaminoacid,thepolypeptidechainmustbehydrolysedtoisolateandidentifythelabeledaminoacid.What'sneededisawaytoremovethefirstaminoacidwithouthavingtohydrolyzethewholechain.Thiswassol

4、vedbyPerEdman,inSwedenin1956,byusingthereagentphenylisothiocyanatetolabeltheN-terminalendofthepolypeptidesample.ItworksbycleavingtheN-terminalAAoffandleavingtherestofthepeptideintact.TheEdmanmethodcanberepeatedonthepeptideremainingafterthereaction,sothisisaveryeffecti

5、vemethodforobtainingAAsequenceinformation.InfactthewholesequenceofapeptidecontainingmanyAAscanbedeterminedbyEdmanmethod.降解反应分三步偶联PITC的异硫氰酸酯基与蛋白的自由－氨基作用，产生苯氨基硫甲酰蛋白质。裂解PTC－蛋白质在无水条件下酸裂解，切下反应的那个残基，暴露出下一个自由－氨基。转化ATZ－氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液条件下，转化成稳定的PTH－氨基酸。PTH－氨基酸的鉴定薄层层析，HPLC,GC

6、(气相色谱），质谱分析等。PTH－氨基酸ATZ－氨基酸2.C端序列分析适用1.鉴定重组蛋白是否正确表达2.大规模生产时质量控制3.N端封闭蛋白的分析4.DNA探针的设计原理化学试剂与蛋白质和多肽的羧基反应，反应后的C末端衍生物被切割下来，通过HPLC系统进行分析。质谱：MassSpectrometry(MS)指带电原子，分子或分子碎片按质荷比(m/z)的大小顺序排列的图谱。二、生物质谱技术质谱（MS）技术的基本原理样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。软电离技术：离子化过程中不会破坏分子结构电

7、喷雾电离（ESI)基质辅助激光解析电离（MALDI)质谱仪组成：离子源，质量分析器，检测器MALDI–MS电离基本原理：将分析物分散在基质分子中并形成晶体。激光照射晶体时，使基质晶体升华，基质和分析物膨胀并进入气相。TheMALDIinstrumentisamatrixassistedlaserdesorptionionisation-time-of-flight（TOF)massspectrometer，specificallyforhighthroughputmassmappingofpeptidedigestfragment

8、soriginatingfromproteinsexcisedfrom2D-gelsi.e.proteomics.matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectromet