玉龙雪山土壤样品放线菌分离与探究

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1、玉龙雪山土壤样品放线菌分离与探究　　摘要：从玉龙雪山土壤样品中分离出放线菌27株，进行抑菌活性、基因序列、基因簇分析和筛选。结果表明，玉龙雪山土壤样品中的放线菌属于Streptomyces、Rhodococcus属，大部分菌株对金黄色葡萄球菌有抑菌活性，大多含有聚酮类化合物、非核糖体多肽合成基因，具有产生聚酮类化合物和非核糖体合成多肽活性产物的潜力。关键词：玉龙雪山；放线菌；分离；化合物合成基因中图分类号：Q93文献标识码：A文章编号：0439-8114（2013）12-2810-02StudyandIsolationofActinobacteriafromJadeDr

2、agonSnowMountainSoilOUYANGYong-chang，CHENZe-ping，OUJun-hao（DepartmentofBiotechnology，GuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510182，China）Abstract：27strainsofactinomyceteswereisolatedfromsoilsamplescollectedfromJadeDragonSnowMountain，Yunnanprovincebyactinomycetesculturemedium.BasedonthePCR-R

3、FLPofthe16SrRNAgenes，theseisolatesweredividedinto7groups，whichwereinitiallyidentifiedasgenera7StreptomycesandRhodococcusbyphylogeneticanalysis.Allisolateswerescreenedforantimicrobialactivesandgenesencodingpolyketidesynthases（PKS）andnonribosomalpeptidesynthetases（NRPS）.Theresultsshowedtha

4、talmostallisolateshavePKS，NRPSgenesandantimicrobialactivitiesinindicatorsofStaphylococcusaureus.Keywords：JadeDragonSnowMountain；actinomycetes；isolating；synthesisgenesofsecondarymetabolites放线菌是一类重要的微生物资源，医药和农业中应用的抗生素中有100多种来源于放线菌[1]，同时放线菌还能产生酶（蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等）、维生素、有机酸等生物活性物质[2]，具有巨大的利用价值。随着

5、研究的深入，为获得独特的放线菌资源，研究者从特殊环境和海洋中分离放线菌并研究其活性产物[3-5]。目前鲜见关于玉龙雪山土壤放线菌的研究报道，试验从玉龙雪山土壤样品中分离放线菌并对其抑菌活性和次生代谢产物的潜在产生能力进行研究。1材料和方法1.1材料土壤样品采自云南丽江玉龙雪山，采集地海拔45507m，植被为森林，采集距离地表土层2～3cm的土壤。1.2放线菌的分离取样品10g加入10mL无菌水，充分振荡混匀后取上清液连续进行10倍稀释，取稀释3、4、5次后的稀释液200μL均匀涂抹于高氏培养基上，28℃培养2～4周后进行放线菌分离，经纯化培养后进行下一步研究。1.3PC

6、R-RFLP和进化分析对分离纯化的放线菌菌株进行DNA提取，提取方法按照文献[6]。16SrRNA基因分析的引物为27F（5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1500r（5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′），其PCR体系参照文献[7]。利用HhaⅠ酶切进行RFLP分析，反应体系为HhaⅠ0.2U、PCR产物3μL、ddH2O和酶切Buffer补齐至20μL，酶切3h后用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析酶切类型。从每个酶切类型中选取1个代表菌株，将其16SrRNA基因的PCR产物送Invitrogen上海公司测序，测序结果提交GenBank数

7、据库并与其他序列进行比对，利用MEGA4.0软件Neighbor-Joining法构建系统进化树[7]。1.4抑菌活性的测定指示菌为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）和大肠杆菌（Escherichiacoli）。抑菌圈大于17mm则认为目的放线菌有抑制指示菌的活性（阳性），若小于1mm则认为目的放线菌没有抑制指示菌的活性（阴性）。1.5PKS和NRPS合成基因的检测利用PCR方法筛选目的菌是否有聚酮类化合物（PKS）Ⅰ型、Ⅱ型和非核糖体合成多肽（NRPS）化合物的合