分子生物学实验技术.doc

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1、分子生物学实验技术课程简介:分子生物学实验技术已成为高水平医学科学研究中最常用的方法,本课程简要介绍有关基础知识，着重系统地进行有关操作技能的训练。教学方式：通过实际操作，掌握有关知识和技能。选课建议：本课程分四部分：DNA分析技术、RNA分析技术、PCR技术、蛋白质分析技术。请根据自己的研究方向所需技术手段选择其中三项内容。每部分人数限定72人（PCR技术不限人数）。考核办法：实验报告+考试成绩开设部门：生物科学系总学时：80教学内容：序号主要内容主讲人实验员一、DNA制备及分析技术实验一、质粒的提取和纯化徐建余朱壮春实验

2、二、质粒的酶切、鉴定及片段的回收周天戟王艳茹等二、RNA制备及分析技术实验三、RNA的提取实验四、RNA变性琼脂糖凝胶电泳实验五、探针的标记实验六、Northern杂交三、PCR技术实验七、聚合酶链反应四、蛋白质分析技术实验八、SDS-PAGE及分子量的测定实验九、Western-Blot实验十、凝胶图谱分析实验一质粒DNA的提取和纯化一、质粒DNA的提取质粒：pBS[GAPDH]为4.0kb，其pBS载体2.8kb，GAPDHcDNA片段1.2kb。宿主菌：E.coliHB101试剂：STE:0.1mol/LNaCl10m

3、mol/LTris·Cl(pH8.0)1mmol/LEDTASolI:(该液可配制100ml，67600Pa即10磅灭菌15分钟，4°C储存)50mmol/LGlucose25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTASolII:(含0.2NNaOH、1%SDS，新鲜配制)10％SDS4ml1NNaOH8ml水28mlSolIII:(含3mol/LKAc、2mol/LCH3COOH,pH4.8)5mol/LKAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml碱裂解法小提质粒1.提取琼脂板上的单菌落，移至含有3

4、mlLB培养液（含适当的抗生素）的培养三角瓶（20ml），37°C，强烈摇振过夜。（挑出3~5个菌落分别培养）1.取出培养液1ml移至Ep管中，4°C，12000g，30秒。2.弃上清，用1mlSTE悬浮菌体沉淀，再离心回收菌体；再重复用1mlSTE悬浮菌体沉淀，离心后，弃上清。3.将细菌沉淀悬浮于100ml冷SolI中，强烈混匀。4.加200mlSolII，颠倒离心管5次混匀悬液，冰浴3分钟（根据不同菌株可适当缩短时间：暴露在强碱性溶液中过长，共价闭合环状质粒DNA可发生不可逆的变性，导致内切酶切割困难，质粒DNA迁移率降

5、低一倍左右，EB染色效率底）。5.加150mlSolIII，颠倒混匀10秒，冰浴3-5分钟。6.12000g，4°C离心5分钟，取上清移至新Ep管。7.加等体积酚/氯仿(1:1)，振荡混匀；12000g，4°C离心2分钟。8.取上清至新管，加2倍体积95%乙醇（RT），振荡混匀，室温放置2分钟（不要-20°C沉淀，否则有较多盐析出）。9.12000g，4°C离心5分钟，弃上清。10.加1ml70%冷乙醇，振荡漂洗沉淀。4°C12000g2分钟。11.弃上清，吸净管壁上的乙醇水珠，室温蒸发痕量乙醇。12.加入50mlTER（p

6、H8.0）（TE中含无DNA酶的RNA酶20mg/ml）溶解DNA，短暂振荡5分钟后可进行内切酶酶切实验，或-20°C储存。二、质粒DNA的纯化聚乙二醇沉淀法本方法经济简单，纯化的质粒可适用于细菌转化、酶切，尤其对减裂解法提取的质粒纯化效果更好。1.3ml质粒液移至一离心管加入3ml冷5mol/LLiCl，混匀，4°C,12000g,10分钟。2.将上清分装2管，加等量的异丙醇，混匀静置2分钟。室温12000g，10分钟。3.弃上清，流尽残夜，加70％乙醇漂洗沉淀及管壁。4°C,12000g,5分钟。弃上清，室温蒸发残存乙醇

7、。4.加500mlTER(含无DNase的胰RNase20mg/ml的TE,pH8.0)溶解沉淀，将溶液移至新Ep管，室温放置30分钟。5.加500ml13%(w/v)聚乙二醇(PEG8000)的1.6mol/LNaCl，充分混匀，用12000g离心5分钟，以回收质粒。6.弃上清，用400mlTE(pH8.0)溶解沉淀质粒DNA。7.用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次。8.上清移至Ep管，加100ml的10mol/L乙酸铵，混匀，加2倍体积（约1ml）乙醇，混匀，室温10分钟。4°C,12000g,10分钟。9.弃上清（暂时保存上

8、清，以防止不完全沉淀），200ml冷70%乙醇漂洗质粒DNA。4°C,12000g,2分钟。10.弃上清，蒸发残存乙醇。11.加500mlTE(pH8.0)溶解DNA(此步可适当减少TE量，以防浓度过稀)，-20°C保存。12.测OD260、OD280值，进行DNA定量及纯度判断。5ml样