内标2教程文件.ppt

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1、内标2目录定量方法外标定量法内标定量法外标定量法与内标定量法优缺点我们公司为什么使用外标定量，而不是内标定量什么是内标内源性内标外源性内标竞争性内标非竞争性内标总结定量方法外标定量和内标定量定义？外标定量法外标定量法是将样本和阳性标准品在两个反应体系内进行，通过不同浓度梯度的阳性标准品绘制标准曲线，从而对样本内起始模板浓度进行定量分析。外标定量法是在获得已知浓度标准品和未知浓度样本Ct值后，绘制标准品的标准曲线，再根据样本的Ct值来确定样本的其实模板浓度。内标定量法内标定量的方法是在待测样品中加入已知拷贝数的的内标，同样通过标准曲线来确定样本的起始拷贝数。数学

2、计算公式：[QS](2△CT)QS………………………内标浓度△CT……………………内标与样本CT值的差外标定量法与内标定量法优缺点外标定量法难以排除假阴性的实验结果；内标定量法虽然可以排除假阴性的实验结果，但是PCR反应变成双重PCR反应后，无法加入合适数量的已知模板作为内标，因此国内大部分厂家都采用外标定量法。我们公司为什么使用外标定量，而不是内标定量内标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，虽然可以监测假阴性，但是PCR反应变成双重PCR，根据KeLD等人的研究，双重PCR反应中存在存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板起

3、始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。荧光定量PCR无需内标定量实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：（1）Ct值的高度重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放

4、大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。（2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。AppliedBiosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时

5、检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。什么是内标来源特性内源性内标外源性内标竞争性内标非竞争性内标内标内源性内标定义：为一个出现在每一个试验样本中的特定RNA和DNA。通过使用内源性内标这种主动性参比，对于加入到每一个反应中的总RNA量的差异，其可以校正靶mRNA的定量。外源性内标定义：为一个以已知浓度加入至每个样本中的特性确定的RNA和DNA,外源性主动参比通

6、常为体外构建的，可作为内阳性质控以鉴别有PCR抑制所致的假阴性。外源性参比也可用来校正样本或cDNA反转录的合成效率。竞争性内标竞争性内标指的是人为构建的可与待测样本模板竞争Taq酶、dNTP和引物标准品。本公司主要是指竞争相同的引物。构建方法：将目的扩增片段进行突变、删除（缺失）、插入一小段序列。使得在荧光PCR中，探针的结合区域有所差异。非竞争性内标是指人为构建的不与待测样本竞争引物，而是从新设计一段引物。总结通过验证试验证明外标法加入适量的内标，虽然变成双重PCR,但是对样本的定量几乎没有影响。我公司的内标是为了克服外标定量法而加入的标准品，主要目的是用

7、来监测样本的假阴性。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢