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1、组织和细胞培养第九章细胞遗传学性状检测一、性染色质检测女性的两个X染色体中的一个,间期染色质呈异固缩,呈深染的小体称Barr氏体。Barr氏体位于间期细胞核内面,呈三角形或半月形小体,易为碳酸复红或硫堇等染料着色,正常女性Barr氏体阳性,男性为阴性,男性Y染色质位于间期细胞核近中央部,易为盐酸阿的平着色,荧光显微镜下观察发较强荧光,呈点状小体,发光部分系Y染色体异固缩的长臂,初代培养细胞和二倍体细胞株均可观察到性染色质,传代细胞系表现不规律。碳酸复红显示X染色质法：染色液:干液:碱性复红3g,溶100ml70%乙醇中,可保
2、存 工作液:(现用现配)干液10ml;5%石碳酸水溶液90ml;冰醋酸10ml;甲醛(40%)10ml染色步骤:(1)细胞:BSS洗,染色5-10min,如用涂片应待片干后,迅速投入96%酒精固定10-15min再染色; (2)分化:96%酒精分化1min,分化时要不断摇动; (3)脱水:通过纯酒精1分钟; (4)封片:二甲苯透明2-3min，树胶封固。结果:细胞质不着色,细胞核染成紫红色,阳性Barr氏体附于细胞核膜内面呈三角形或半月形小体。荧光染色显示Y染色质法：荧光染液：PBS100ml；盐酸阿的平0.2g 染色:Y染
3、色质显示染色与染色体荧光显带法相同。 结果:在荧光显微镜下观察,Y染色质呈特别明亮黄绿色荧光圆点,直径0.25-0.3微米,可位于核内任何位置,但以近中央时居多。二、培养细胞染色体显示法 显示染色体主要显示分裂中期细胞,因细胞分裂处于中期时,染色体长短和大小恰到好处,是研究染色体的最好阶段。所以,第一需要获得多量的中期分裂相;第二,人类染色体有46条,密集在细胞中,相互交错缠绕,必须把它们分散开,才便于观察。1.提高细胞分裂相数：刺激细胞增殖:分P和M两型,M型作用较强,PHA特别适用于外周血淋巴细胞培养,有强烈的刺激T淋巴
4、细胞增殖的作用,用量每10ml培养液加PHA0.2ml。阻抑中期分裂:秋水仙素法:秋水仙素有特异抑制纺锤丝蛋白合成作用，能阻抑分裂中期活动，而对DNA作用较小，借此可截获很多中期分裂相，产生类似提高分裂指数的效应。该药有强烈的毒性，用量过大或作用时间过长，可使染色体缩短和发生异常分裂现象。 低温处理:把指数生长期细胞放置到室温或冰箱中4℃4-12h，因温度降低时DNA合成受抑制，细胞不进入分裂期，当恢复用37℃温箱培养并用秋水仙素后，会出现代偿性分裂高潮，也产生提高分裂相数效应。2.促染色体分散措施：低渗处理:应用低渗盐溶液
5、处理,可使细胞体积胀大、染色体松散，便于制备染色体标本。低渗可用蒸馏水、1%枸椽酸钠、加水稀释培养液(1:3),0.075MKC1等方法。目前最多用的是0.075M的KC1,在37℃水浴中作用20-40min，效果最好。醋酸固定:大多数固定剂都使组织细胞收缩，而醋酸却有膨胀固定作用，和醇类混合固定有利于染色体松散效应。现多应用醋酸/甲醇混合液固定，用时宜现用现配。3.传代培养细胞染色体显示法培养细胞:指数生长期,80%-90%汇合单层细胞;加秋水仙素:终浓度为0.02-0.8µg/ml营养液;温箱继续培养6-10h;或用低温
6、封闭法:把培养细胞置于4℃条件下6-12h,再于37℃温箱中继续培养6-10h;采集分裂细胞:可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点,令培养液在培养细胞表面反复冲涮,应用此法可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落;离心:收集培养液,1000转/分钟离心5-10min;低渗处理:吸除上清液,加入预温至37℃的0.075MKCl溶液,在温箱中静置20-30min;预固定:向悬液中加新鲜醋酸/甲醇固定液1ml;固定:离心,去上清,加固定剂5-10ml;置15-20min;重复一次,去上清，余下固定液0.5-1ml;制片:洗净载物片
7、,预冷,向片的一侧滴2-3滴细胞悬液，滴片时的距离能保持半米高度。滴片后置室温中令其自然干燥，或用吹风机热风吹干亦可;染色和封片:一般常用Giemsa染色;染色1O分钟后，水洗、晾干、可直接观察(适用油浸镜);如标本需 要保存或做长时间观察，可过二甲苯两次后，用中性树胶封片(或先迅速过丙酮两次，每次30秒)后，再过二甲笨，然后封片亦可。4.人末梢血微量全血培养染色体显示法：显示人染色体过去主要取骨髓培养,利用其中干细胞能进行增殖显示染色体,末梢血淋巴细胞是已发生分化,处于功能态和无分裂活动细胞,但在PHA的诱导下,T淋巴细胞
8、重新进入增殖态发生细胞分裂,为获得淋巴细胞可用多量血分离和微量全血培养两种方法。培养液准备:取15ml培养瓶数个,每瓶内分别含青霉素100单位,链霉素100µg/ml,PHA0.1ml,培养液共5ml抽血针管准备:取2-5ml针管一支，肝素润洗针管；采血:静脉取血1-2ml;无菌操作迅速向
