牦牛胰脏中糜蛋白酶的分离纯化及部分特性研究.docx

《牦牛胰脏中糜蛋白酶的分离纯化及部分特性研究.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、牦牛胰脏中糜蛋白酶的分离纯化及部分特性研究糜蛋白酶是一种来源于脊椎动物的消化酶，在治疗消炎和抗癌方面具有良好的药用价值。本研究以青海大通牦牛胰脏为原料，采用单因素试验和响应面分析法Box-Behnken试验方法对缓冲液浸提、超声波萃取、ChTRP活化工艺进行优化，获得糜蛋白酶提取的最佳工艺参数；并通过单因素试验对PVS精提工艺进行优化，进一步提高其酶活，同时对纯化后的酶采用SDS-PAGE及分子量的鉴定；最后对鉴定的酶进行部分特性的研究。主要研究结果如下：(1)提取剂筛选：选取五种不同的提取剂浸提牦牛胰脏组织匀浆，通过单因素试验优化得到以0.

2、002mol/LTris-HCl作为浸提缓冲液的浸提效果最佳时，酶活力为106.5U/mL，是以异丙醇和水浸提所得酶活力的2倍。(2)浸提工艺单因素优化：选取不同的Tris-HCl缓冲液浓度、肉样与缓冲液体积比和浸提温度进行单因素试验，得到最佳Tris-HCl缓冲液浓度为3mmol/L，其酶活为187.9U/mL，最佳肉样与缓冲液体积比为1:3，其酶活为180.5U/mL，最佳浸提温度为5℃，其酶活为190.5U/mL。(3)浸提工艺Box-Behnken响应面优化：显著影响酶活力的因素主次顺序为：浸提缓冲液浓度＞浸提温度＞肉样与缓冲液体积比

3、，且影响均呈正效应。最佳缓冲液浸提工艺为：浸提缓冲液浓度为4.0mmol/L、缓冲液与肉样体积比为3.0、浸提温度为5℃。在此最优工艺条件下，牦牛胰脏中糜蛋白酶活力为203.7U/mL。(4)超声波萃取工艺单因素优化：选取不同萃取功率、萃取时间和萃取温度进行单因素试验，得到最佳萃取功率为700W，其酶活为216.6U/mL，最佳萃取时间为6min，其酶活为184.8U/mL，最佳萃取温度为5℃，其酶活为160.7U/mL。(5)超声波萃取工艺Box-Behnken响应面优化：显著影响酶活力的因素主次顺序为：萃取温度＞萃取功率＞萃取时间，且影响

4、均呈正效应。筛选出最佳工艺参数：超声波萃取功率为755W、萃取时间为7.5min、萃取温度为4℃时，其酶活力为216.3U/mL。(6)ChTRP活化工艺单因素优化：选取不同pH值、Trypsin添加量、活化时间和温度进行单因素试验，得到最佳pH值为8，其酶活为184.5U/mL，最佳Trypsin添加量为0.4mg，其酶活为187.9U/mL，最佳活化时间为120min，其酶活为202.8U/mL，最佳温度为25℃，其酶活为194.2U/mL。(7)ChTRP活化工艺Box-Behnken响应面优化：显著影响酶活力的因素为pH值、Tryps

5、in添加量、活化时间和温度，其影响大小依次为：活化时间、pH值、温度、Trypsin添加量。并通过Box-Behnken响应面试验，以糜蛋白酶活力为指标，筛选出最佳工艺参数pH值为7.4、Trypsin添加量为0.4mg、活化时间为125.9min、温度为32℃时，其酶活力为221.76U/mL。(8)PVS精提：在25℃时，当PVS浓度为0.015mol/L对糜蛋白酶聚合效果最强；当PEI浓度为4.E-06mol/L时，糜蛋白酶聚合物的溶解效果最佳，酶活力达到592.4U/mL，提取率为14.95%。SDS-PAGE鉴定纯度达到电泳纯，分子

6、量约为25ku。酶学特性：最适反应pH值为8.0，在pH值7.5～9.0、18～38℃的条件下糜蛋白酶稳定性最高；金属离子Ca2+、Cu2+、Mn2+、K+、Fe3+、Fe2+、Zn2+对该酶均有不同程度的抑制作用，其抑制率达到0.4%～14%；Km=0.57mmol/L，Vmax=0.0055μmol/min。综上所述，采用缓冲液浸提、超声波萃取、ChTRP活化、PVS聚合纯化技术从牦牛胰脏中将糜蛋白酶分离纯化至电泳纯，该酶具有耐酸耐热性，可被金属离子抑制。本研究具有工艺简单、生产周期短、所制的糜蛋白酶质量高等特点，因此，利用先进的生物分离

7、工程技术进行糜蛋白酶的生产，提高酶的收率及活力，在生化制药业中以及动物副产品综合利用中具有积极的意义。