牛蒡苷元的制备及其抗肿瘤作用机制.docx

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1、牛蒡苷元的制备及其抗肿瘤作用机制恶性肿瘤是严重威胁人类健康的的主要疾病之一,全球平均每8个死亡病例中就有1人死于癌症。目前,大多数的抗肿瘤药物虽然具有一定疗效,但仍然存在着副作用大、价格昂贵等诸多劣势。因此,寻找新型、高效、低毒的抗肿瘤药物是我们面临的巨大挑战。我国的传统医学在治疗肿瘤方面有着悠久的历史,中草药中含有多种具有很强抗肿瘤作用的植物单体,如何将其分离提取出来并进行合理的开发利用,成为了世界医学面临的重要课题。现代药理学研究证明,中药牛蒡子具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性。其主要有效成分牛蒡苷(Arctiin,ARC)在人体内生物利用度低,需经肠道微生物酶解转化

2、为牛蒡苷元(Arctigenin,ARG)方能吸收入血液,发挥药效。目前,药学研究用ARG多为实验室自制,其制备方法都或多或少存在着一些不足之处,如提取效率低、步骤繁杂、对实验室设备要求高等。本研究采用微生物发酵法和硅胶柱层析法从牛蒡子粉中分离纯化ARG,成功建立了一种简便高效的提取方法。此外,据相关报道,ARG可以抑制多种恶性肿瘤细胞的生长,但对于其抗肿瘤作用的分子机制却知之甚少。本研究选取人肝细胞癌作为研究对象,对ARG体内外抗肿瘤机制进行了深入探讨。ARG的制备:本研究采用微生物发酵法,筛选出泡盛曲霉变种和里氏木霉作为发酵菌种,利用两株霉菌所产生的生物酶对牛蒡子粉进行炮制

3、,将牛蒡子粉中的牛蒡苷转化为牛蒡苷元。并且通过对发酵过程中碳源、氮源、发酵时间、pH、装液量、接种量、发酵底物固液比、碳氮比等诸多因素进行优化,制定出一套牛蒡子粉最佳发酵工艺,可使牛蒡苷转化率达97.8%,产物溶出率达95.7%,损失率低至4.3%。最后采用硅胶柱层析法纯化牛蒡子发酵粗提物,牛蒡苷元纯化产物为白色晶体,纯度可达到99%以上。ARG体外抗肿瘤机制研究:通过MTT比色法检测ARG在体外对肿瘤细胞株和正常细胞株的增殖抑制活性,结果表明ARG具有良好的广谱抗癌活性,但对正常细胞却没有明显的抑制作用。为进一步研究ARG的抗肿瘤机制,本研究选择人肝细胞癌作为研究对象,通过A

4、nnexinV-FITC/PI双染法、透射电镜观察、线粒体跨膜电位检测、和Hoechst33342/免疫荧光染色等试验方法从细胞形态学和分子生物学角度说明ARG可以诱导HepG2和SMMC7721细胞的凋亡。而后,采用qPCR、流式细胞仪和Westernblot等试验技术检测细胞凋亡信号通路及凋亡相关因子。结果发现,当ARG作用于HepG2细胞时,首先会破坏细胞线粒体的氧化还原功能,同时使NADPH酶和细胞色素P450酶参与的代谢过程发生异常,从而导致细胞中ROS水平升高。在ROS的影响下,MAPK信号通路中JNK和p38被激活,两者共同促进了HepG2细胞内源性凋亡途径的活化

5、,于此同时,p38参与激活其外源性凋亡途径并上调p53的表达。最终,在两条凋亡途径共同作用下,细胞中的caspase蛋白群被激活,从而介导了HepG2凋亡的发生。此外,ARG还可以抑制HepG2细胞中NF-κB的核转移和PI3K/Akt信号通路的激活。上述结果表明ARG是一种“多靶点”化合物,它可以通过调节细胞中的多种信号转导来诱导细胞的凋亡。ARG体内抗肿瘤机制研究:在对裸鼠人肝癌移植瘤进行体内抑癌作用研究中发现,ARG对人肝癌移植瘤具有显著的抑制作用,20mg/kgARG对HepG2移植瘤抑瘤率可达44.55%。并且几乎不会对荷瘤小鼠的一般状态及肝、肺、肾等主要脏器产生不良

6、影响。进一步研究发现,ARG在体内抑制肿瘤组织的生长是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。其主要作用机制是通过上调p-JNK、p-p38、Bax以及TNF-α的表达介导细胞凋亡的发生。ARG体内抗肿瘤研究说明ARG不仅可以抑制肿瘤的生长,同时具有低毒的作用特点,此研究结果为ARG的进一步开发奠定了试验基础。综上所述,本研究发明建立了一种简便高效的ARG提取方法,适合于实验室自行提取制备ARG,并且此方法具有成本低廉、提取纯度高、污染少等诸多优点。在此基础之上,本研究对ARG的抗肿瘤作用及其体内外作用机制进行了深入探索。研究结果表明,ARG在体内外均具有良好的抗肿瘤作用,其作用机制主要

7、是通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖。与此同时,研究还发现ARG在体外几乎不会对正常组织细胞产生抑制作用,且在动物体内具有低毒的作用特点。由此可见,ARG是一种极具开发潜力的抗肿瘤化合物,本项研究为ARG的进一步开发利用奠定了试验基础。