最新不可培养微生物研究进展教学讲义ppt.ppt

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1、不可培养微生物研究进展不可培养微生物的概念Colwell实验室在1982年提出活的但不可培养微生物的概念，他们发现将霍乱弧菌和大肠埃希菌（简称大肠杆菌）转到不含营养物质的盐水中，经长时间的低温保存，细菌会进入一种数量不减、有代谢活力、但在正常试验室培养条件下不能生长产生菌落的状态，称为活的但不能培养（viablebutnonculturable,VBNC）状态。其后对多种属细菌进行试验证明，这种不可培养状态是普遍存在的。自然界中也广泛存在着这种活的但不可培养微生物，在各种生境中仅有小部分的微生物可用实验室方法分离培养，而未被培养的种类却

2、代表了巨大的多样性。严格说来,这个概念并不严谨。所谓不可培养,其实应该是在当前认识水平或实验条件下的不可培养。实际上,通过合适的培养方法,某些细菌是可以实现培养的。例如在培养基中加人降解过氧化氢的过氧化氢酶或者非酶类的降解物如丙酮酸钠等,可以使处于不可培养状态的大肠杆菌恢复培养〕。又比如,一种滕黄色微球菌的自分泌生长因子讨以皮摩尔浓度加人到培养基中,可以提高从腹腔巨噬细胞裂解物中分离感染的结核分枝杆菌的比率其中有部分是不可培养的。Joseph等发现,通过改进一些简单的培养方法,就可以使实验室培养土壤细菌的种类和数量得到很大的提高。细菌V

3、BNC诱导的具体例子：低营养诱导的VBNC细胞有霍乱弧菌、痢疾志贺菌、肠球菌、大肠埃希菌、沙门菌等。P.Mary等[3]研究了进入VBNC细胞的营养条件,把气单胞菌放在4!的寡营养的无菌蒸馏水中7周则观察不到可培养菌落的数量,这表明已经进入到了VBNC状态。如果在25!培养10周以上,有活力的细胞的数量降低到了0.8对数单位,这时细菌已经进入到了经典饥饿状态,可以观察到缩成球形的VBNC细胞。大多数文献资料显示,温度是诱导细菌进入VBNC状态最重要的因子,而且温度常和寡养条件协同作用。S.M.Nel?son等[4]研究表明,在只提供少量

4、氮源、无碳源的情况下E.coli在5!培养1000h可进入VBNC状态,通过各种方法测定的特定温度下的菌落数的结果是一致的。温度诱导的VBNC细胞有军团杆菌、创伤弧菌等。NaCl对多数肠道菌的生长影响较大,徐怀恕等[1]发现E.coli在25%NaCl环境中培养96h比在5%NaCl下培养同样时间进入VBNC状态的细菌数目高出40倍之多。此外,氧化、渗透压等因素也可以诱发VBNC状态的出现。链缩短,青霉素结合蛋白在VBNC阶段消失。Tholozan[8]发现,Campylobacterjejuni进入VBNC状态后膜内外pH梯度、膜内K

5、+浓度和膜势能均降低,ATP及ADP浓度降低,30d后仅能检测到AMP存在。二、细菌VBNC状态的生物学特性1、VBNC细菌的形态细菌进入VBNC状态后形态会发生改变,大多数的杆菌和弧菌进入VBNC状态后会缩成球状,特别是G-杆菌表现尤为明显。Signoretto等[5]研究VBNC状态的G-菌粪肠球菌(Entero?coccusfaecalis)的形态变化时发现其不但没变小,反而有轻微的伸长。2、VBNC细菌的生理、生化特性细菌进入VBNC状态后,菌体对底物利用减少,核糖体及染色质等物质密度明显降低,细胞质浓缩,蛋白质和脂质总量下降。

6、ScottARice等[6]对Vibriovulnificus的核酸分析表明,进入VBNC状态的细胞最初具有完整的DNA和RNA,并具有可恢复正常状态的能力。随着保持VBNC状态的时间增长,核酸不断降解,其中部分细胞已经不具备恢复正常状态的能力。CaterinaSignoretto等[7]分析了E.coliKN126的肽聚糖化学组成的变化,表明二氨基庚二酸交联度(DAP?DAP)增加了2倍,胞壁肽共价结合脂蛋白的量增加,肽聚糖链缩短,青霉素结合蛋白在VBNC阶段消失。Tholozan[8]发现,Campylobacterjejuni进入

7、VBNC状态后膜内外pH梯度、膜内K+浓度和膜势能均降低,ATP及ADP浓度降低,30d后仅能检测到AMP存在。3、VBNC细菌的致病性研究表明,病原微生物进入VBNC状态并不代表它们失去致病能力。Colwell等[9]证实,注射VBNC状态的Vibriocholerae仍能导致测试人员腹泻,同时发现此菌在进入VBNC状态28d后,仍能产生霍乱毒素,PCR检测说明产生霍乱毒素的基因仍然存在。W.Baffone等[10]将进入VBNC状态的VibrioparahaemolyticusATCC43996注入Balb/c小鼠肠管内结扎,分别在

8、第2、4、8和12天解剖2只小鼠进行尸检,结果表明50%的小鼠被感染。Rahman、M.Habibur等[11]将VBNC状态的Aeromonashydrophila注入金鱼体内,发现VBNC状态下细菌仍能