最新外源基因在真核细胞中表达及调控-药学医学精品资料.ppt

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1、最新外源基因在真核细胞中表达及调控-药学医学精品资料第一节       真核细胞基因表达的调控一、真核生物基因表达的特点及优势二、真核细胞表达及调控元件第二节       哺乳动物细胞表达系统的选择标记基因一、胸苷激酶基因选择标记（定义）二、二氢叶酸还原酶基因选择标记三、新霉素抗性基因选择标记四、氯霉素已酰转移酶基因选择标记五、黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（XGPRT）基因胸苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（thymidineKinase,TK）在所有真核细胞中都有表达,是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶,它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP,继续磷酸化生成dTTP,参与D

2、NA的生物合成。一、载体的类型1.质粒型载体2.病毒载体3.整合型表达载体4.游离型表达载体5.瞬时表达载体6.稳定性表达载体7.非复制性HSV-Ⅰ病毒（单纯疱疹病毒HSV-Ⅰ型）载体8.裂解性HSV-Ⅰ病毒载体二、几种常用的真核表达载体㈠逆转录病毒载体1.卸甲载体2.穿梭载体㈡痘类病毒载体㈢HSV-Ⅰ单纯疱疹病毒载体1.重组病毒型载体2.重组质粒型载体3.裂解型病毒载体（一）真核生物基因转录水平的调控基因调控的顺式作用元件启动子增强子RNA剪接信号负调控元件终止子和polyA信号基因调控的反式作用因子概念反式作用因子主要作用规律（二）转录后水平的调控mRNA前体加工：转

3、录的mRNA前体经5’加帽，3’酶切加尾去除内含子后，产生成熟mRNA，通过核孔进入胞质中。RNA编辑（RNAediting）（三）翻译水平的调控翻译起始序列eIF-2的磷酸化反应由模板来源的遗传信息，进而可编码产生不同氨基酸序列的多种蛋白质，这是生物适应性的保护措施。顺式作用元件顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列DNA片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录按效应和功能可分为启动子、增强子、RNA间接信号、负调控元件、终止子等调控元件。反式作用因子主要作用规律同一DNA序列可被不同蛋白质识别同一蛋白质因子可与多种不同

4、DNA序列发生联系，多数是通过蛋白质-蛋白质先相互作用后，再与DNA结合，发挥调节作用。反式作用因子的自身生物合成有相当大的可变性、可塑性。反式作用因子与顺式作用元件相互作用的特定结构域，有两种类型：通用转录因子的结构域为识别特异DNA的DNA结合结构域，如：锌指结构。转录调节因子的结构域又称转录活化结构域，如：酸性α-螺旋结构域。不同结构域各自的特征不同结构域各自的特征通用转录因子的DNA结合结构域锌指结构亮氨酸拉链螺旋-转角-螺旋（HTH）螺旋-环-螺旋转录调节因子的转录活化结构域RNA编辑（RNAediting）RNA编辑是在转录时或转录后，能够改变RNA分子编码特

5、性，是与剪切形式不同的一种修饰形式，如可使mRNA某位点密码子CAA转变为UAA，使C变U，编辑的结果形成了UAA终止密码子，在编码酶的作用下，除使C变U，还可在RNA上添加多个U或呈单个C的添加，使前体mRNA变成成熟mRNA时，通过插入或替换方式，可改变和扩大原遗传信息，编码多种蛋白,是生物的适应性保护。翻译起始序列在ATG起始密码子周围要有5’-CCACCA-TGG-3’保守序列，以利mRNA翻译起始，若发生突变，其翻译水平可下降10倍。在起始AUG上游若有比较多的二级结构序列，也会影响翻译，建议外源基因的5’端AUG上游序列不宜过长。eIF-2的磷酸化反应eIF-

6、2为转译起始因子-2是蛋白质合成起始阶段13种起始因子中最为关注的因子。若转入动物细胞中的质粒DNA的两条链一旦都发生转录，就会形成双链互补mRNA，而激活胞内的双链RNA激活的蛋白激酶（DAIPK）该激酶可使eIF-2的α-亚基磷酸化，转译受抑，为防止该激酶活化，常在载体上加上腺病毒的VARNA基因，VARNA是由RNA聚合酶Ⅲ合成的小分子RNA，能阻止双链RNA对DAI激酶的激活作用，使转译得以正常进行。一、胸苷激酶基因选择标记外源基因+载体(TK+)的重组体导入TK-细胞中，在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷）选择培养基中筛选，TK-细胞因氨基喋呤抑制了dT

7、TP的合成而死亡，TK+细胞可存活，以此进行筛选。（HSV-1的TK基因转染细胞加GCV后被杀死，如小鼠LMTK-细胞。）注：TK++BrUdR因掺入后对紫外线敏感而死亡，TK-+BrUdR因不掺入，对紫外线不敏感而存活。二、二氢叶酸还原酶基因（DHFR）选择标记DHFR是合成dATP和dGTP的关键酶。常用DHFR—的CHO细胞因不能合成四氢叶酸，只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培养基中生长。在不含该培养基中导入该标记基因重组子，则可筛选出阳性克隆，也可将DHFR基因置在强启动子下高表达或通过DHFR基因突变以提高抵抗高