最新实验9 具体步骤结果PPT课件.ppt

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1、实验9具体步骤结果实验思路确定目标基因，目标生物DNA提取目标基因PCR扩增PCR产物纯化pUC19骨架进行重组转化大肠杆菌重组子筛选琼脂糖电泳琼脂糖电泳PCR电泳蓝白斑筛选引物序列（红色标记为pUC19的同源序列）CG1844 length 200PrimerF15’-acacaggaaacagctatgaccatgattacgccaaacggattgccgagtaacacPrimerR15’-cacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgactatgtggcgccttcattcCG7050length250PrimerF25’-acac

2、aggaaacagctatgaccatgattacgccacctcgaaattgaaccgaaaaPrimerR25’-cacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgttactgcggttgattccacaCG8864length237bpPrimerF35’-acacaggaaacagctatgaccatgattacgccagttaacatccgcagccaactPrimerR35’-cacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgacccacacagaggcacctac第12周DNA提取和PCR扩增DNA提取：以果蝇为例

3、课件介绍电泳检测DNA质量和大致浓度PCR扩增，具体操作见课件介绍原理和实验步骤。图一果蝇基因组DNA提取电泳图Marker:15000bpPCR程序Takara公司的PremixTaqTMHotStartVersion成分使用量PremixTaqHS25μl上游引物2μl下游引物2μl总基因组1.5μlddH2O(20μl)Upto50μl循环参数32cycle94℃90sec94℃30sec57℃30sec72℃45sec72℃10min4℃取5μl扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。图二PCR电泳检测图M2112233图二PCR电泳检测图M2112

4、233图二PCR电泳检测图M2112233第13周DNA纯化、重组和转化1：DNA纯化，试剂盒完成，根据买回来的试剂盒来完成实验步骤2：重组，以pUC19为骨架，进行重组；购买重组酶试剂盒完成；3：转化DNA纯化1.实验试剂上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒2.实验步骤DNA纯化1.实验试剂上海生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒2.实验步骤DNA纯化2.实验步骤第13周DNA纯化、重组和转化本实验的骨架是puc19载体第13周DNA纯化、重组和转化第13周DNA纯化、重组和转化第13周DNA纯化、重组和转化(1uL)(4uL)(灭菌)(1uL

5、)第13周DNA纯化、重组和转化转化建议所使用的感受态细胞效率≥1×108cfu/μg.1）冰上融化一管100μl的DH5a感受态细胞，加入5μl已稀释的的反应液到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上孵育30分钟。2）42℃水浴中热激90秒后快速放入冰上3分钟。3）加入500μlSOC液体培养基，37℃复苏45-60分钟。4）9,000rpm离心3分钟收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板（Amp.50-100ug/mL)上。5)37℃培养18-24h后，平板置于4℃保存。第14周重组子筛选单克隆菌落直接PCRPCR原理和步骤同第13周。电泳检测菌落P

6、CR从平板任意挑选5个菌落，用灭菌牙签挑取菌落（不要掺杂培养基及挑取过多菌体）成分使用量PremixTaqHS10μl上游引物0.8μl下游引物0.8μl菌落--ddH2OUpto20μl循环参数32cycle94℃90sec94℃30sec57℃30sec72℃45sec72℃10min4℃菌落PCR结果的琼脂糖电泳验证1.5%agarosegel:60mL1XTAE+0.9gagarose+0.6uLGoldViewMarker:SangonDNAMarkerDCatB600336-0260PCR产物3-8uL+Loadingbuffer(6X)1uL电泳条

7、件130V约30-60min班级结果:下午（左）、晚上（右）晚上班的从marker开始依次为：1.2A,2.2A,3.2遗传学综合性实验要求如下，1）实验报告以综合性小论文方式提交；2）每人自己写一份，注明小组成员，同时小组成员之间论文不能完全雷同，结果图相同，文字陈述不能完全拷贝；3）论文重点突出同源重组问题，部分结果不理想试验组重点分析试验中出现的问题；论文前言最好了解一下相关资料，比如同源重组的原理以及相关基因的信息；4）实验论文提交最后时间为2015年6月15日（第16周星期一）。5）针对图的结果，都要把自己小组的结果陈述清楚，不能只有图，没有文字！最后

8、论文成绩占总成绩30%喔