表面增强拉曼散射标记免疫检测再生性探究

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1、表面增强拉曼散射标记免疫检测再生性探究　　【摘要】目的：探讨表面增强拉曼散射标记免疫检测技术的循环利用问题和价值。方法：采用4，4’-联吡啶和苯硫酚制备金溶胶作SERS标记分子，并组装抗原抗体复合物，用其进行SERS检测，通过对SERS谱图的分析识别加入的抗原，重点研究固相抗体的重复使用方法。甘氨酸-HCI缓冲体系能彻底分离抗原和抗体，在SERS标记免疫检测中，能通过实验研究该体系对基底再生性和稳定性的影响。结果：使用甘氨酸-HCl缓冲体系对抗原抗体复合物进行洗脱，在洗脱时间为24h时，抗原和抗体能充分分离，因此清除了抗体上的标记免疫溶胶和抗原。第二次制备抗原抗体复合物时，基底的再

2、生能力良好，重复使用的次数可达约10次，同时能继续识别标记分子，并进行SERS检测，具有稳定性。结论：通过甘氨酸-HCI生物缓冲体系洗脱是一种洗脱基底再生效果好和稳定性强的方法。【关键词】表面增强拉曼散射；标记免疫检测；再生性doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.15.0718拉曼光谱是在分子水平上研究物质结构的一种重要的工具，已广泛应用于分析科学领域[1]，表面增强拉曼光谱克服了普通拉曼光谱检测灵敏度低的缺点[2]，是灵敏度较高的研究界面效应的技术之一，能最大限度地应用于研究吸附分子在表面的取向及吸附行为、吸附界面表面状态、生物大分子的界面取向及构型

3、、构象和结构分析[3]。在商品化的实际应用中，需要强调产品的可再生利用性，需采用真正可行的抗体抗原分离方式，同时不影响抗体抗原的活性与特异性[4]。在以上理论的基础上，本实验在SERS检测中引入合适的生物洗脱体系——甘氨酸-HCI缓冲体系，以探究本方法的洗脱效果、稳定性和重复使用性。1材料与方法1.1材料用Frens法制备得的金溶胶，粒径大约30～40nm。浓度1mmol/L的苯硫酚和浓度1mmol/L的4，4’-联吡啶分子溶液。3.34mg/L的羊抗人IgG。小牛血清白蛋白（BSA）（5%p）。pH9的硼砂缓冲溶液。美国FullMoonBioSystems公司的生物芯片。TBS/

4、0.1%Tween、TBS和三次水。1.2方法1.2.1制备金溶胶作免疫标记用Frens法制备得到紫红色浑浊的金溶胶，粒径大约30～40nm。将浓度1mmol/L的苯硫酚1μl和浓度1mmol/L的4，4’-联吡啶0.48μl两种标记分子溶液分别加入金溶胶中做标记，同时对标记溶胶进行多次离心，之后重新悬浮，以去掉多出来的标记分子。把3.34mg/L的羊抗人IgG5μl加进标记溶胶中，在室温下充分反应后，对标记溶胶再次离心，使其悬浮。选择5%p的BSA即小牛血清白蛋白把表面的空位进行封闭，然后离心，在硼砂缓冲溶液（pH9）的作用下，再实现溶胶的悬浮。1.2.2制作固相抗体抗体使用的稀

5、释液是硼砂缓冲溶液（pH9），稀释的浓度以每毫升200～500μg为宜，之后把稀释好的液体滴在美国FullMoonBioSystems公司的生物芯片所做的固相基底上，形成拉曼光谱的采集点。环境湿度维持65%～75%，把上面所制作好的芯片放入，12h后拿出，然后放在普通室温中，干燥0.5h。1.2.3组装三明治结构的复合物和进行SERS检测把之前制得的抗体分别在BSA溶液（5%）中、人抗原的缓冲溶液中和标记免疫金溶胶溶液振荡0.5h、2～4h和2h，在每次震荡后分别用三次水以及TBS/0.1%Tween、TBS和三次水依次冲洗，再分别用氮气吹干。制得“固相抗体-待测抗原-标记免疫金溶

6、胶”，它是三明治结构的复合物，可以用该抗体来进行SERS检测。1.2.4仪器使用的仪器与设备有LEO-1530型扫描电子显微镜、法国Jobin8Yvon公司的HR800共聚焦激光拉曼散射仪、He-Ne激光器、电荷耦合检测器和100倍的长焦镜头物镜。1.2.5选择洗脱体系先用人抗原和羊抗人抗体制备抗原和抗体的复合物，第一次选择强酸的盐酸溶液（pH2）进行洗脱，让基底在强酸溶液中震荡，震荡2h，把4，4’-联吡啶作为免疫标记分子，第二次组装三明治结构的复合物，用来进行SERS检测，观察SERS谱图。在看到生物缓冲体系的作用后，采用甘氨酸-HCI（0.2mol/L）生物缓冲体系，调节体系

7、的pH值，使pH为2，再把已制备好三明治夹心结构的基底浸入其中。观察洗脱之前、洗脱5h、洗脱10h、洗脱24h后测得的SEM图。1.2.6洗脱后基底的稳定性选择羊抗人抗体抗原和苯硫酚，把后者作为标记分子，制备抗原抗体复合物。然后再用用甘氨酸-HCI体系对复合物洗脱，分别在暗处放置在10d、1个月、2个月后，第二次制备三明治结构。分析经过静置再次组装的三明治结构SERS谱图。1.2.7观察载体的重复使用性洗脱基底1、5、10次，再分别进行组装，第二次抗原检测以苯硫酚作为