最新Western-blot实验方法步骤..课件PPT.ppt

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1、Western-blot实验方法步骤..概论它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题。具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。溶解蛋白策略1使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这可能导致免疫反应性的丢失。2采用温和的

2、条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力，变性蛋白比天然蛋白更容易降解。往往可以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调整提取的条件。为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血清或多种单克隆抗体的混合物，因为他们可与某一蛋白的多种形式起反应。主要试剂RIPA（华舜公司）苯甲基磺酰氟PMSF（华舜公司）丙烯酰胺（Amresco公司）双丙烯酰胺（Amresco公司）丽春红染料（华舜公司）Tween20（Amres

3、co公司）过硫酸铵（Sigma公司）四甲基乙二胺TEMED（Sigma公司）硝酸纤维素膜（Amersham公司）考马斯亮兰（Fluka公司）兔抗大鼠Glut1多克隆抗体（SantaCruz公司）Phototope-HRPWesternBlotDetectionSystem（CellSignalingTechnology公司）仪器与设备低温超速离心机（Eppendorf公司）分光光度计（Eppendorf公司）Thermomixer（Eppendorf公司）电泳仪（Bio-Rad公司）垂直式电泳槽（Bio-Rad公司）硝酸纤维素膜电转系统（Bio

4、-Rad公司）配制试剂10×电泳Buffer称取Tris-base30.3克glycine144克加去离子水，定容至1000mlSDS10克1.5MTris.HClPH8.8称取18.15克Tris，加60mlddH2O溶解，调PH至8.8，定容100ml0.5MTris.HClPH6.8称取6.0克Tris，加60mlddH2O溶解，调PH至6.8，定容100ml转膜缓冲液称取3.03克Tris.base，14.4克Glycine，用ddH2O溶解，定容至800ml，临用前加200ml甲醇10*：30.3克Tris.base，144克Glyc

5、ine，用ddH2O溶解，定容至800ml。配制试剂30％Acry-Bis29克丙烯酰胺＋1克双丙烯酰胺，加ddH2O100ml配成，避光4℃保存10％过硫酸胺，新鲜配制，<1week0.1克过硫酸胺加ddH2O1ml配成，4℃保存封闭试剂10×TBS（应用液：1×TBS）10×TBS：取24.2克Tris－Base80克氯化钠用800mlddH2O溶解后，用HCl调PH至7.6，定容至1000ml1×TBS：取10×TBS50ml，稀释至500ml，临用前加0.1％Tween20，500ul。配制试剂4×SDSSampleBuffer2.4克

6、TrisHCL，溶解在30ml水中，调pH6.88克SDS0.4克溴酚兰定容至100ml40ml甘油10mlDTT贮存液1mol/LDTT贮存液：0.01mol/L乙酸钠20ml3.09克DTT过滤除菌后-20℃保存，分装成1ml。考马斯亮兰染液：45ml甲醇45ml水用Whatman滤纸过滤，去除颗粒状物质10ml冰乙酸0.25克考马斯亮兰R250抗体选择一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象（例如变性构象或天然构象）。并非所有的单克隆抗体都适合作为探针用于WETERN-BLOT，因为这一实验中靶蛋白是彻底变性的。多克隆抗血清是由单一

7、免疫球蛋白组成的不确定混合物，通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知。因而不可能预言用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白上的不同抗原表位的效果。设置对照：1不与靶蛋白反应的抗体（即免疫前血清或非相关单克隆抗体）2样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的制品选用抗变性蛋白的高滴度多克隆抗血清或单克隆抗体混合物为佳。实验步骤配胶制胶先用1ml枪头小心铺10%分离胶，上加少许异丙醇，待分离胶干凝后，倒去异丙醇，用水洗去多余未聚合的胶，滤纸吸干。再铺4%积层胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶干后备用，拔去梳子。上样，所有上样孔均加

8、样，没有样本，用上样缓冲液代替。100V，溴酚兰走到分离胶底部后，1.5h后电泳结束。实验步骤转膜小心取下凝胶，把预先在转膜缓冲液中平衡过的Whatm