食品中诺如病毒检测 标准文本.doc

《食品中诺如病毒检测 标准文本.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、GB4789.2—201xxxxx-xx-xx实施xxxx-xx-xx发布中华人民共和国卫生部发布2010-06-01实施2010-××-××发布食品安全国家标准食品微生物学检验食品中诺如病毒检测（征求意见稿）1GB4789.2—201x前言本标准代替SN/T1635—2005《食品中诺沃克病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法》。本标准与以上标准相比，主要变化如下：——标准名称修改为“食品微生物学检验食品中诺如病毒检测”；——增加了检验程序；——修改了病毒富集步骤；——删除了普通RT-PCR检验方法。107GB4789.2—201x食品安全国家标准食品微生物学检验食

2、品中诺如病毒检测1范围本标准本标准规定了食品中诺如病毒的测定方法。本标准适用于食品中诺如病毒总数的测定。2术语和定义2.1实时荧光RT-PCRreal-timefluorescence在普通RT-PCR的基础上加了一条特殊性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。2.2C值cyclet

3、hreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1无菌平皿，直径90mm；3.2无菌手术剪；3.3无菌镊子；3.4无菌50ml离心管，耐氯仿，可高速离心；3.5无菌85ml离心管，耐氯仿，可高速离心；3.6无菌胶头滴管；3.7无菌移液管，10ml；3.8移液枪，1-1000ul；3.9匀浆机；3.10超净工作台；3.11天平，精密度为0.01g；3.12高速冷冻离心机，10000g；3.13恒温摇床；3.14荧光定量PCR仪。4试剂4.1含0.3mol/lNaCl的甘氨酸缓冲溶液，配制方法见A.

4、1；4.2PEG8000，配制方法见A.2；107GB4789.2—201x4.3病毒RNA提取试剂盒；4.4Nuclisens裂解液；4.5逆转录试剂盒；4.6荧光PCR定量试剂盒；4.7缓冲液1×TAE，配制方法见A.3；4.8溴化乙锭（EB）溶液10ug/uL，配制方法见A.4；4.9琼脂糖凝胶，配制方法见A.5。5检验程序无菌操作，取食品5g，加入25ml缓冲溶液匀浆37℃孵育30min或室温震荡30min，离心取上清，加10ml氯仿，震荡，离心取上清，加入等体积PEG8000，混匀冰上放置1h，离心，弃上清，用2mlNuclisens裂解液溶解沉淀使用QIAGEN试剂盒提取病毒

5、RNA使用诺沃克病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针），定量检测诺沃克病毒6操作步骤6.1诺如病毒的富集6.1.1在无菌平皿中进行无菌取样，取食品5g，加入25ml含0.3mol/lNaCl的甘氨酸缓冲溶液，匀浆3min，为避免匀浆过程产生的高温破坏病毒，分两次匀浆，中间停顿1min。107GB4789.2—201x6.1.2将均质液转移到50ml离心管中，恒温摇床37℃孵育30min或室温震荡30min，4℃，10000g离心30min。6.1.3取上清，转移到另外的离心管中，加入10ml氯仿，充分震荡，放置10min，中间震荡一次，4℃，10000g离心30min。6.1.4取上清液

6、25ml转移到85ml离心管中，加入等体积的PEG8000溶液（PEG的终浓度为8%），充分震荡混匀。6.1.5在冰上放置至少1h，4℃，10000g离心5min，弃上清，加入2mlNuclisens裂解液溶解沉淀，如不马上进行检测，将沉淀用1ml无菌水重悬，-70℃保存，避免反复冻融。6.2诺如病毒RNA提取使用商品化的病毒RNA提取试剂盒提取和纯化，步骤参考说明书，提取完成后，为延长RNA保存时间可选择性加入RNase抑制剂，操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套，并经常更换。6.3实时荧光RT-PCR以诺如病毒RNA作为阳性阳性对照，以不含诺如病毒的样品RNA作为阴性对照，以水代替模

7、板作为空白对照，每个体系设置两个平行反应.可根据具体情况调整总体积。6.3.1实时荧光RT-PCR反应体系实时荧光RT-PCR反应体系见表1表1实时荧光RT-PCR反应体系名称储存液浓度终浓度加样量/uLGⅠGⅡRT-PCR缓冲溶液10×1×55MgSO25mmol/L1mmol/L22dNTPs10mmol/L0.2mmol/L11上游引物20umol/L1umol/L2.52.5下游引物20umol/L1umol/L2.52.5