gbt 28099-2011 水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法

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1、ICS65．020．01B16蝠园中华人民共和国国家标准GB／T28099--2011水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法DetectionandidentificationofXanthomonasoryzaepv．oryzicDf口(Fangeta1．)Swingseta1．2011-12-30发布2012—06—01实施宰瞀徽紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会厦19月U吾GB／T28099--2011本标准按照GB／T1．1--2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标

2、准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、南京农业大学。本标准主要起草人：易建平、林石明、周国粱、粟寒、印丽萍、孔德英、许志刚、胡白石。1范围水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法本标准规定了水稻细菌性条斑病菌的检测和鉴定方法。本标准适用于水稻种子及植株上水稻细菌性条斑病菌的检测与鉴定。2规范性引用文件GB／T28099--201下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日

3、期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN／T0800．1进出口粮油、饲料检验抽样和制样方法SN／T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3水稻细菌性条斑病菌基本信息中文名：水稻细菌性条斑病菌(稻黄单胞菌稻生致病变种)。学名：Xanthomonasoryzaepv．oryzicola(Fangeta1．，1956)Swingseta1．，1990，简称Xoc。异名：Xanthomonascampestrispv．oryzicola(Fangeta1．，1956)Dye1978；Xanthomonasoryzicol

4、a(Fangeta1．，1956)Dowson1943；Xanthomonastranslucensf．sp．oryzicola(Fangeta1．，1956)Bradbury1971。病害英文名：bacterialleafstreakofrice。属细菌界Bacteria，变形细菌门Proteobacteria，7变形细菌纲Gammaproteobacteria，黄单胞菌目Xanthon∞nodales，黄单胞菌科Xanthomonodaceae，黄单胞菌属Xanthomonas(Dowson，1939)。病菌主要在病种子和病草上

5、越冬，其次在水稻再生苗或李氏禾等杂草上越冬。病菌主要借雨水、流水等传播，带菌种子是远距离传播的主要途径之一。水稻细菌性条斑病菌的其他信息参见附录A。4方法原理根据症状特征、菌落形态特征、生理生化特征、PCR反应和致病性测试结果等进行检测鉴定。5主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。三羟甲基胺基甲烷盐酸盐(Tris—HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(sDs)、十六烷基三甲基溴化胺(cTAB)、三氯甲烷、异戊醇、乙醇、蛋白酶、溴化乙锭、酵母粉、琼脂、蛋白胨、牛肉浸膏、营养肉汤、葡萄糖、蔗糖、谷氨酸钠。培养

6、基和试剂配方见附录B。1GB／T28099--2016仪器用具超净工作台、高压灭菌锅、生物显微镜、培养箱、电子天平、冰箱、离心机、水浴锅、培养皿、三角瓶、剪刀、电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定系统、微量可调加样器和离心管。7检测与鉴定7．1现场检疫按照SN／T2122和sN／T0800．1规定的程序进行现场检疫并抽取样品。7．2实验室检测7．2．1有症叶片的分离有症叶片用无菌水冲洗后取病斑前沿2mm～7mm部分用70％酒精表面消毒15s，无菌水洗三次后用无菌剪刀剪碎，置于无菌载玻片上，加一滴无菌水，不加盖玻片，

7、置于显微镜下观察喷菌现象，如观察到喷菌现象，从喷菌处用接种环取一环处理液在NA(PsA或NBY)培养基平板上划线分离，重复3个平板，27℃培养3d～5d。7．2．2无症叶片的分离取10张无症叶片，剪碎研磨后提取DNA，进行PCR检测，DNA提取程序和PCR检测程序见附录c。阳性样品进行病菌分离。另取无症叶片10张，无菌水冲洗叶面，70％酒精表面消毒15s，无菌水洗三次后用无菌剪刀剪碎，加入适量无菌水，静置15rain，用接种环取处理液在NA(PSA或NBY)培养基平板上划线分离，重复3个平板，27℃培养3d～5d。7．2．3从种子中

8、分离种子处理液在培养基上富集后进行PCR检测，100g种子磨碎后置于200mL含有0．01％Tween20的无菌水中4℃过夜，取100pL处理液在PSA培养基平板上涂布，重复3个平板，27℃培养2d，每个平板用1mL无菌水洗下，取洗板