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1、华中科技大学博士学位论文实验用方法步骤Sup1.1PCR（使用TransgenePCRTaqMix，货号：20915）1.在PCR反应管中调制反应液：ReagentQuantity,for25µlofreactionmixtureTaqDNAPolymeraseMix12.5µl10µMPrimer上游1µl10µMPrimer下游1µlcDNA1µlSteriledeionizedwaterUpto25µlTotal25µl/Sample①反应体系根据实际情况调整②将上述各成分加入到0.2ml的PCR薄壁管中；2.PCR扩增：StepTempe
2、rature,°CTime,minNumberofcyclesNote起始变性9531变性940.530-35退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化退火60-700.5延伸720.5-1.5每分钟延伸1000bp最终延伸72101反应结束后，取扩增样品5µl，琼脂糖凝胶电泳分析结果，DNAmarker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备分析使用。30华中科技大学博士学位论文Sup1.2琼脂糖核酸电泳1．用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放于制胶板上，架好梳子；2．根据DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的凝胶：称量琼脂糖干粉，加入
3、三角烧瓶内，加入TAE电泳缓冲液（20~30ml）；3．微波炉内加热熔化，冷却片刻，加入荧光染料(EB)，充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4．室温下凝胶完全凝结后，拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5．倒入电泳缓冲液（量以没过胶面1mm为宜），除去样品孔内气泡；6．DNA样品中加入10×Loadingbuffer，混匀，将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7．接通电源，红色为正极，黑色为负极，使DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。电压60～100V，电泳时间20～40min；8．根据指示剂泳动的位置，待指示剂到达胶3
4、/4处时终止电泳；9．在凝胶成像仪上观察电泳带及位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5%1,000～30,0000.7%800～12,0001.0%500～10,0001.2%400～7,0001.5%200～3,0002.0%50～2,000Sup1.3胶回收纯化DNA1．琼脂糖电泳，将目的条带用刀切下放入到EP管中，称量重量；2．按照每100mg加400µl的量加入bindingbuffer，57℃振荡器中温育振荡，直至溶解；3．取
5、出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2min，8,000rpm离心1min，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；4．加700µl的washbuffer至柱中，8,000rpm离心30sec，弃收集管中的液体；5．加500µl的washbuffer重复洗涤一次，最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30sec，除去残留的washbuffer；6．将纯化柱放入一个新的EP管中。加30~40µlH2O或者Elution30华中科技大学博士学位论文buffer至纯化柱膜的中央，室温放置2min，10,000rpm离心1min洗脱DNA
6、，将DNA溶液放置-20℃保存备用。Sup1.4酶切（应用NEB限制性内切酶，双酶切）1.确定待切样品的浓度，选择合适的限制性内切酶和Buffer。2.在0.5ml的EP管中加入如下成分：ReagentQuantity,for40µlofreactionmixture10×ReactionBuffer4µl限制性内切酶12µl限制性内切酶22µl待切样品xµl（根据浓度确定）SteriledeionizedwaterUpto40µlTotal40µl/Sample3.混匀样品，离心使样品沉于管底。4.将离心管置于37℃中温育1-3hr。5.用未酶
7、切的质粒或DNA片段作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。Sup1.5连接（应用NEBT4DNA连接酶）1.确定待经酶切回收后的载体和片段的浓度。2.在EP管中加入如下成分：ReagentQuantity,for40µlofreactionmixture10×ReactionBuffer4µlT4DNA连接酶2µl待连接样品载体与片段的mol比为1∶4SteriledeionizedwaterUpto40µlTotal40µl/Sample3.混匀样品，短暂离心使样品沉于管底。4.16℃连接过夜，连接完的样品直接用于转化或-20℃冰箱保存备用。Sup
8、1.6转化（应用Transgene公司DH5α感受态细胞）1.取一只感受态细胞于冰上融化。30华中科技大学博士学位论文1.加入1μl纯质
