第二代测序技术简介

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1、第二代测序技术（Next-GenerationSequencing）NGS之基础篇  2001年，美、英、法、德、日、中六国合作，历时十年，耗资数十亿美元的人类基因组计划（HumanGenomeProject，HGP）宣告完成。转眼又是十年过去，在此期间，各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，这其中最大的突破，就是第二代测序技术的推出。HGP的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究，然而，高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求，无不限制着对遗传密码的进一步认识。从HGP开始的第一天期，科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究，“鸟枪法”就是其中

2、之一。2006年，美国X大奖基金会（www.xprize.org）设立了奖金高达1000万美元的基因组ArchonX大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队。而罗氏（Roche）、应用生物系统（AppliedBiosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。  2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——GenomeSequencer20System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。随后，罗氏公司以1.5

3、5亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GSFLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（basepair），且准确率达到99%以上。2008年，GSFLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。虽然454GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（denovo）和宏基因组测序（metagenome）方面有着不可替代的地位。  2006年，Solexa公司也推出了自

4、己的NGS系统——GenomeAnalyzer，简称GA。这套基于DNA簇（DNAcluster）、桥式PCR（BridgePCR）和可逆阻断（Reversibleterminator）等核心技术的系统具有高通量、低错误率、低成本、应用范围广等优点。2007年，Illumina公司以6亿美元的高价收购了Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次运行可获得1Gb的数据，因此也有1GbAnalyzer的含义，而最新的Hiseq2000平台则能够在10天的运行中获得300Gb以上的数据，读取的碱基长度达到150bp左右。更有消息称，Illumina已完成了6

5、00Gb的运行测试并在部分客户中开展了前期体验，Tb（1000Gb）级的测试Run也将于年内进行。据不完全统计，Illumina公司已售出超过600台/套GAIIx和Hiseq2000平台，2010年仅深圳华大基因研究院一家就购买了128台Hiseq2000，一举成为全球最大的基因组测序与分析中心，Illumina公司在测序领域的影响力由此可见一斑。  在Sanger测序时代，美国应用生物系统公司（ABI）一直是该行业的龙头老大，其垄断地位无人能撼，从早期的377到全自动化的3730xl，ABI的测序仪被广泛应用在基因组学研究的各个方面。然而在第二代测序技术迅猛

6、发展之初，ABI起步较晚，显得有些漫不经心。直到2005年454公司推出GS平台，ABI的领先地位受到威胁，这才开始发力，迅速收购了研发NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD测序平台。此后SOLiD不断升级，目前已到SOLiD5版本（SOLiD5500xl）。SOLiD的全称是SequencingbyOligoLigationDetection，即寡聚物连接检测测序，其基本原理是通过荧光标记的8碱基单链DNA探针与模板配对连接，发出不同的荧光信号，从而读取目标序列的碱基排列顺序。在该方法下，目标序列的所有碱基都被读取了两遍，因此

7、SOLiD最大的优势就是它的高准确率。据悉，SOLiD5平台的测序通量已达到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，准确率高达99.99%。并且由于SOLiD系统采用的不是PCR反应进行DNA合成与测序，因此对于高GC含量的样本，SOLiD系统具有非常大的优势。NGS之进阶篇  454的焦磷酸测序原理，简单来说就是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用，将PCR反应每一个碱基（dNTP）的延伸与一次荧光信号的释放偶联起来，通过记录荧光信号的有无和强度，达到实时测定DNA序列的目的。在454测序仪中，A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试

8、剂瓶中的，每步反应四种碱