血清蛋白的分离——

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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳法血清蛋白的分离——(1)学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板及圆盘电泳的操作技术。目的要求聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N—甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感

2、物核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引发自由基团。实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶体系有连续和不连续电泳之分。不连续电泳系统由浓缩胶和分离胶两种胶体组成，两种胶体分别由不同的pH的缓冲液和胶贮液配制而成，形成孔径不同的两种胶体。不连续电泳系统电泳分离过程中包括三种物理效应，即样品的浓缩效应、电泳分离的电荷效应和凝胶的分子筛效应。本次试验采用不连续电泳系统PAGE，通过三种效应将血清中各蛋白质组分按其分子大小、电荷多少不同进行分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳有圆盘电泳和垂直板电泳之分，但两者的原理完全相同，只是所用的电泳槽不同。由于

3、时间问题，本次试验将分两组进行，一组使用圆盘，一组使用垂直板。夹心式垂直板电泳槽，圆盘电泳槽，电泳仪，直流稳压电源，玻璃板（13×13），注射器及微量注射器抽气泵，干燥器，培养皿，玻璃棒，吸量管，烧杯，滴管，玻璃管，薄膜手套，滤纸，日光灯实验仪器制备分离胶、浓缩胶有关试剂：凝胶缓冲液，分离胶贮存液，0.8%过硫酸铵；浓缩胶缓冲液，浓缩胶贮存液，40%蔗糖溶液，核黄素。Tris-甘氨酸电极缓冲液（PH8.3）已加入溴酚蓝指示剂的血清样品染色液（氨基黑）1%琼脂（糖）溶液脱色液（7%乙酸溶液）由学生自己配制实验试剂一、垂直板聚丙

4、烯酰胺凝胶电泳1.凝胶的制备：（1）安装夹心式电泳槽将长短玻璃板分别插到U形硅橡框的凹形槽中（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），在长玻璃板下端与硅胶橡框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂糖且两玻璃板内下端处处有琼脂糖（其目的是封住空隙，凝固后的琼脂中应避免有气泡），琼脂凝固后，将硅胶橡框装入电泳槽内，以对角线的方式将螺丝帽旋紧。实验步骤试剂名称用量（ml)分离胶缓冲液（ph8.9）2.5ml分离胶凝胶贮液5.0ml蒸馏水2.5ml将以上三种试剂混合均匀后，置于真空干燥器中抽气10min过硫酸铵，置于真空干燥器中，抽气10min10

5、.0ml（2）分离胶的制备按上表格配胶，二者抽气后混合均匀，小心不要在溶液中搅出气泡，以免过多接触空气。迅速用滴管将混合后的分离胶装在二块玻璃板之间至短板上端约3-4cm，并用注射器在起上面加一层水约1mm使凝胶形成时有一水平面，（注意加水时，不要引起胶面的大波动）。在室温中放置，当两界面出现不同折射率时表明已凝胶，时间大约40分钟，以出现折射率不同的界面为准，再室温下放置十分钟，使凝胶充分。将分离胶上层的水倒去，再用滤纸吸去多余的水（注意不要碰破胶面），为下一步做准备。试剂名称用量（ml)浓缩胶缓冲液（ph6.7)0.5m

6、l浓缩胶贮液1.0ml40%蔗糖2.0ml将以上三种试剂混合均匀后，置于真空干燥器中，抽气10min核黄素0.5ml(3)浓缩胶制备：按上表所示配胶，抽气后加核黄素0.5ml,混匀，立即加入到已配制好的分离胶上面至短玻璃板上端约0.5cm，插入加样梳，放于日光灯下10分钟左右浓缩胶就开始凝胶，30~50分钟左右凝好（凝缩胶变为乳白色为准），凝好后小心拔去加样梳。将Tris—甘氨酸电极缓冲液稀释10倍后倒入电泳装置的左、右槽中，短玻板一侧要稍微超过玻板，长玻板一侧只要越过电泳丝的高度。用微量注射器通过缓冲液在每个加样凹槽中加入

7、约5ul的样品。2.加样将样品端(短玻璃的一边)接直流稳压电泳仪的负极，接通冷却水，开始电泳。开始时电流控制在10mA，待样品进入分离胶时，将电流调至30mA左右。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘琼脂界面处0.5cm左右时，电泳完成。将缓冲液回收至试剂瓶中，还可用1-2次（注意将正负级的缓冲液分开回收）。3.电泳4.剥胶将固定螺丝旋松，取出硅橡胶框，将一块玻璃板轻轻剥开，然后用玻璃棒将胶板取下放入培养皿中。5.固定，染色在培养皿中倒入氨基黑染色液至覆盖胶板，染色分钟左右，此时染色与固定同时进行。（染色液要回收利用）6.脱色用7

8、%乙酸浸泡数次，直至背景蓝色脱去。1.凝胶的制备：（1）安装圆形玻管将洗净的玻璃管烘干后用橡胶玻璃头封严，放置在一边等待灌胶。二圆盘聚丙酰胺凝胶电泳(2)分离胶制备按垂直板的方案进行配胶，混匀后迅速用滴管分装在玻璃管中至玻璃管上端约2-3cm，并用注射器在起上面加一层水约1mm使凝胶形成时