质粒dna的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题

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1、1．实验目的：（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；2．实验材料及用品（1）实验仪器（apparatus）：恒温培养箱（Constanttemperatureincubator）、恒温摇床（Constanttemperatureshakingtable）、高速离心机（Highspeedcentrifuge）、漩涡振荡器（Vortexmixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（

2、beaker）、量筒（graduatedcylinder）、玻璃棒（stirbar）、微波炉（microwave）、天平（Panbalance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresistank）、电泳器（Electro-phoresisSystem）、紫外灯（Ultraviolettransilluminator）3）、材料与试剂（Reagents）：①溶液I（SolutionⅠ）：50mmol/L葡萄糖；25mmol/L三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mm

3、ol/L乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。②溶液Ⅱ（SolutionⅡ）：新鲜配制，等体积混合0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1%SDS（可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。③溶液III（SolutionⅢ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀60mL5mol/LKAc，11.5mL冰醋酸，28.5mLH2O（该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）④

4、TE液缓冲液：10mmol/LTris-HCl（pH8.0）；1mmol/LEDTA（pH8.0）⑤70%乙醇；⑥平衡酚：氯仿1：1：将量取25mlTris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24ml氯仿和1ml异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。⑦LB培养基：胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl15gpH7.0⑧琼脂糖（Agarose）；⑨1liter（升）5×TBE备用溶液（stocksolution）：54gtrisbase，27.5g硼酸（boricacid），20ml0.5mol/LEDT

5、A,pH8.0；⑩6×凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝（bromophenolblue），40%蔗糖（sucroseinwater）；另外还有的试剂是：胰RNA酶、DNAMarker、硼酸、Gelview试剂（2）实验材料：含有pUC19质粒的大肠杆菌等。3．实验原理：1）质粒DNA的提取：（1）关于质粒：质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从1kb至200kb以上

6、不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。（2）一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。（3）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：碱裂解法提取

7、质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，因复性较缓慢且不准确而相互缠绕形成不溶性网状结构。而复性的质粒DNA恢复原来

8、构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿可以抽提纯化上清液中的质粒DNA。2）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳：（1）关于电泳技术：电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，