悬浮培养

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1、本科学生综合性实验报告学号074120219姓名吕师留学院生科学院专业、班级07应生A班实验课程名称植物组培实验教师及职称龙维彪开课学期2009至2010学年下学期填报时间2010年7月8日云南师范大学教务处编印一．实验设计方案胡萝卜细胞的悬实验序号实验名称2浮培养及胚状体诱导2010-5-9—实验时间实验室2010-7-8组培实验室1.实验目的1.1掌握细胞培养和胚状体诱导实验的原理与基本操作方法。1.2学会配制实验中用到的两种培养基。2.实验原理、内容及流程2.1实验原理一种在受到不断搅动或摇动的液体培养基（即胡萝卜细胞悬浮培养基）里，培养小细胞团的组织，可以获得

2、高度分散的愈伤组织。将悬浮培养得到的材料经过过滤后，将过滤物加入到胚状体诱导培养基中在摇床上培养，可以诱导产生胚状体。2.2实验内容2.2.1胡萝卜细胞悬浮培养基的配制2.2.2胡萝卜细胞悬浮培养2.2.3胚状体诱导培养基的配制2.2.4胡萝卜体细胞胚的培养2.3流程愈伤组织的诱导——愈伤组织的继待培养——建立高度分散的细胞悬浮液——培养一个星期（振荡培养）——将培养物过滤——将适量过滤液加到胚状体诱导培养集中培养（振荡培养）——观察3.实验设备及材料3.1实验设备普通天平，分析天平，各种型号的试剂瓶（棕色和白色）、移液管、量筒、烧杯、容量瓶，搪瓷杯，pH试纸（pH5

3、.4~7.0），药勺，称量纸，玻棒，标签纸，电炉、镊子、打孔器、培养皿、无菌尼龙滤网、细胞筛等。3.2实验试剂硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA（α-萘乙酸）、6-BA（6-苄基腺嘌呤）、浓盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水、MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、苔酚蓝等。3.3实验材料胡萝卜肉质根愈伤组织4.实验方法步骤及注意事项4.1实验方法

4、4.1.1胡萝卜细胞悬浮培养基的配制配方：MS基本培养基+2mg/LNAA+0.1mg/L6-BA+200mg/L水解酪蛋白+3%蔗糖配制流程：配制调节PH值封口包扎灭菌已知：NAA的原始浓度为:1mg/ml，6-BA的为：0.1mg/ml。经计算可知配制1000ml培养基所需各成分的量为：成分大量微量铁盐有机蔗糖NAA6-BA水解元素元素物酪蛋白需要50ml5ml5ml5ml30g2ml1ml200mg量4.1.2在无菌条件下，用镊子夹取胡萝卜肉质根愈伤组织，置于1个已灭菌的培养皿中，用解剖刀挑取愈伤组织上活跃生长的部分用于接种。4.1.3在每个三角瓶培养集中，接种

5、适量愈伤组织。4.1.4接种后，将三角瓶用封口膜封好，置于摇床上振荡培养。4.1.5胚状体诱导培养基的配制配方：MS基本培养基+200mg/L水解酪蛋白+3%蔗糖配制流程：配制调节PH值封口包扎灭菌经计算可知配制1000ml培养基所需各成分的量为：成分大量微量铁盐有机蔗糖水解元素元素物酪蛋白需要50ml5ml5ml5ml30g200mg量4.1.6培养7——10天后，用细胞筛将培养物过滤，除去滤网上的愈伤组织碎块和大细胞团，然后将滤下的细胞悬浮液（5—10ml）加入到胚状体诱导培养基中，封好封口膜。4.1.7倒出几滴滤液，在倒置显微镜下观察细胞密度。4.1.8把滤液与

6、苔酚蓝1：1的比例混合，再观察细胞的死活程度。4.1.9在老师的指导下，把滤液进行培养。4.1.10将封好的培养基置于25摄氏度下暗培养。4.2注意事项4.2.1在接种过程中，发生了污染，应以淘汰。4.2.2在培养的最初几天中，若培养液出现乳状浑浊，应该淘汰。5.参考文献5.1崔德才，徐培文著，《植物组织培养与工厂化育苗》，2005年08月，化学工业出版社；5.2李胜，李唯主编，《植物组织培养原理与技术》，2008年01月，化学工业出版社；5.3程家胜编，《植物组织培养与工厂化育苗技术》，2003年1月1日，金盾出版社；5.4潘瑞炽编，《植物组织培养》，2003-8-

7、1，广东高等教育出版社；5.5孙静三，桂耀林主编，《植物细胞工程实验技术》北京：科学出版社，1995；5.6王小菁，李玲编，《植物生长调节剂在植物组织培养中的应用》，2002-9-1，化学工业出版社；二．实验报告1．实验现象与结果（1）胡萝卜细胞的悬浮培养（2）胚状体诱导培养液体培养基中新长出了许多细胞团，新长出来的颜色较浅（淡黄色），比较疏松，质轻，悬浮于液体培养基的中上层的少，沉底的较多，瓶壁上也有，但是无胚状体长出。2．对实验现象、实验结果的分析及其结论（1）胡萝卜细胞的悬浮培养在这一步实验比较成功，实验材料没被污染，但是单细胞数不时很多，这可