纯化水细菌、霉菌及酵母菌计数验证方案(交)

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1、纯化水细菌、霉菌及酵母菌计数验证方案1概述:本本法是用于建立微生物检查法时,根据中国药典2005年版二部分要求,需对细菌、霉菌及酵母菌的计数方法进行验证。故计划于2006年9月份对细菌、霉菌及酵母菌的计数方法进行验证。2原理:根据不同的样品,制备成供试液,再将规定量的供试液通过膜微过滤系统真空抽滤,将滤膜进行培养,对形成的菌落计数,或通过采用平皿法对形成的菌落计数,从而了解供试品的微生物含量。3菌种:大肠埃希菌[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌[CMCC(B)65301]白色念珠菌[CMCC(B)98001]黑曲霉[CMCC

2、(B)98003]4培养基:营养琼脂培养基改良马丁琼脂培养基5试剂:pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液0.9%无菌氯化钠溶液6设备:MILLPORE微膜过滤系统7检测方法:7.1菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养琼脂培养基中培养37℃培养18-24小时,用0.9%无菌氯化钠溶液将培养物制备成菌悬液,用细菌比浊管比浊,其浊度与标准比浊管相当后,经梯度10倍稀释至10-5-10-7,约为50-100CFU/ml,供活菌计数及验证试验用。接种白色念珠菌新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中25-28℃培养18-24小时,用0.9%无菌氯化钠溶液将培养

3、物制备成菌悬液,用细菌比浊管比浊,其浊度与标准比浊管相当后,经梯度10倍稀释至10-5-10-6,约为50-100CFU/ml,供活菌计数及验证试验用。接种黑曲霉孢子液至改良马丁琼脂培养基中,经25℃培养5-7天,加入3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,吸取孢子悬液,用细菌比浊管比浊,其浊度与标准比浊管相当后,经梯度10倍稀释至10-4,约为50-100CFU/ml,供活菌计数及验证试验用。7.2活菌计数分别取上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌10-5-10-7稀释液各1ml加入平皿,再用不超过45℃的营养琼脂培养基20ml注皿,每个菌株各测定2皿,3

4、0-35℃培养48小时,计算菌落数。分别取上述白色念珠菌10-5-10-6稀释液、黑曲霉10-4稀释液各1ml加入平皿,再用不超过45℃的琥珀红琼脂培养基20ml注皿,每个菌株各测定2皿,23-25℃培养逐日观察计数。7.3供试液的制备取供试品10ml加入到pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml中,混匀后即为1:10供试液。取上述1:10供试液,加入到pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml中,混匀,作为1:100供试液。7.4回收率的测定薄膜过滤法:7.4.1.试验组:取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜,后取1:100供试液100ml、50-100cfu

5、试验菌同时加入滤杯中,抽滤,后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中,共制备两张滤膜,置规定温度培养规定时间,逐日观察结果。7.4.2.菌液组:取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜,后取灭菌pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml、50-100cfu试验菌同时加入滤杯中,抽滤,后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中,共制备两张滤膜,置规定温度培养规定时间,逐日观察结果。7.4.3.供试品对照组:取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜,后取1:100供试液100ml加入滤杯中,抽滤,后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中,共制备两张滤膜,置规定温度培

6、养规定时间,逐日观察结果。8验证内容、方法及限度:8.1设备确认8.1.1检查验证所使用的设备的检定状,并按下列方式记录检查结果。设备名称及型号产地检定结论备注MILLPORE微膜过滤系统美国8.1.2检查纯化水的细菌、霉菌及酵母菌计数测定的方法验证所需文件。文件名称存放处微生物限度(细菌、霉菌、酵母菌含量)测定标准操作细则三联式Microfil过滤系统使用标准操作细则中华人民共和国药典2005年版二部8.2回收率的计算按如下公式计算试验组的加菌回收率:试验组的平均菌落数—供试品对照组的平均菌落数试验组的加菌回收率=×100%菌液组的平均菌落数8.2试验限度经过三次独立的

7、平行试验该供试品接种5株阳性试验菌株,实施薄膜过滤法检查的加菌回收率均不低于70%9验证参加人员部门姓名职称备注10批准本验证方案报质量保证部门复核并审核。

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