免疫沉淀(immunoprecipitation)实验操作方法

免疫沉淀(immunoprecipitation)实验操作方法

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1、免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法实验原理:免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如proteinA/G特异性地结合到免疫球蛋白(抗体)FC片段的现象而开发出来的特异分离富集抗原的方法。目前多用预先结合固化在Agarosebeads上的proteinA/G(Agrose-proteinA/G),使之与抗体结合,再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G、抗体、抗原复合物,利用Agarosebeads的重量,通过离心即可特异分离富集目的抗原。实验步骤:1.处理细胞:依据实验目的,设计实

2、验,处理好细胞模型。一般3×106细胞/处理(即六孔板一个孔,约200ug总蛋白)。2.配IP裂解液:200ul/孔(6孔板),并加入蛋白酶抑制剂,如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。注意抑制剂的要现加现用。3.收集细胞:冰上操作,裂解细胞前用1×PBS(4度)洗1遍,每孔加入200ulIP裂解液,冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中。4.超声:强度37%,5秒×4次(程序07)。目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但可能会影响蛋白质之间的相互作用,进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。5.离心细胞裂解液:4度10000rpm10分钟。1.Agrose-proteinA

3、/G清洗:一般1ug抗体对应15ulAgrose-proteinA/G(不同公司产品可能不同,注意结合说明书及实验结果考虑),预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量与结合抗体的用量一致。取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中(剪枪头)并用500ul1×PBS(4度)洗两遍,5000rpm×2分钟,吸掉上清备用。2.细胞裂解液预清洗:为去除非特异作用,细胞裂解液先用Agrose-proteinA/G预清洗。转移步骤5离心好的细胞裂解液上清至步骤6洗好的Agrose-proteinA/G中,4度翻转1小时。3.抗体和Agrose-proteinA/G预孵育:为减

4、少游离抗体消耗抗原造成IP效率下降,将抗体和Agrose-proteinA/G进行预孵育。在步骤6洗好的Agrose-proteinA/G中加入200ul含0.1%BSA的IP裂解液及相应量的抗体,4度翻转1小时。不同抗体时间可能有不同。4.抗原抗体孵育:步骤7和8后进行离心(5000rpm2分钟),将预清洗好的细胞裂解液转移到含预孵育好的抗体和Agrose-proteinA/G的EP管中,4度孵育过夜。5.洗IP复合物:步骤9后离心(5000rpm2分钟),吸掉上清,加入IP裂解液(一般不用加抑制剂)500ul,弹匀后4度摇转5分钟,重复6次。最后一次离心后加入3×SDS60ul。6.WB

5、检测。附注:IPlysisbufferTris50mMPH7.4NaCl:150mMEGTA2mMEDTA1mMTritonX-1001%磷酸酶抑制剂:Pyrophosphate2.5mMGlycerolphosphate1mMNa3VO41mM蛋白酶抑制剂:PMSF1mMLeupeptin1ug/mlAprotinin5ug/mlIPlysisbufferReagentFinalconcentrationQuantityTris-base(FW121.1)50mM0.6055gNaCl(FW58.44)150mM0.8766gEDTA(0.5M)1mM0.2mlTriton1%1mlHCl

6、(FW36.46)adjusttopH7.4ddH2OMakeupto100mlNaF(FW:42g/mol)50mM*500.105g/ml焦磷酸钠(265.9g/mol)2.5mM*1000.067g/ml

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