琼脂电泳

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1、实验五DNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验原理DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。0.6~1.4%琼脂糖凝胶适用于3106~11106相对分子质量的DNA分子或片段的分离，所需DNA样品量为0.5~1.0ug。琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶染色。溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外

2、光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA含量。二、试剂与材料1、琼脂糖：1g溶于缓冲液中加热配成100ml。2、pH8.3,Tris-硼酸-EDTA缓冲液：称取10.78gTris，5.50g硼酸，0.93gEDTA-Na2溶于无离子水，定容至1000ml每组250ml3、0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液：取一定量的0.1%溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。100ml/班4、标准DNA溶液；DNA经限制性核酸内切酶EcoRI水解，生成的6个DNA片段，其分子量分别为：13.7106,4.74106,3.7

3、3106,3.48106,3.021062.13106。5、0.5ug/ml溴化乙啶染色液，称取5mg溴乙啶，用无离子水溶解，定容至100ml。从中取1ml，用无离子水稀释，定容至100ml。（有毒，戴手套，在通风柜内进行。）6、水平板型电泳槽7、直流稳压电泳仪8、微量移液枪9、254nm波长紫外分析仪10、DNA样品液：DNA经某种内切酶水解后，得到相对分子质量不同的小片段。三、操作方法琼脂糖胶液的制备：称取1g琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100mlpH8.3Tris-硼酸-EDTA缓冲液，瓶口扣上一小烧杯，加热8-10分钟，琼脂全部融化于缓

4、冲液中。取出摇匀，即为1%琼脂。（也可加溴化乙啶2.5ul）凝胶板的制备用橡皮膏将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或工作台面上（须调水平，将样品槽模板（梳子）插进托盆长边上的凹槽内，距一端约1.5cm）。梳子底边与托盘表面保持0.5一1mm的间隙。待琼脂糖冷至65℃左右。取25mL小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层。液内不存有气泡。室温下静置0.5－lh。待凝固完全后，用小滴管在梳齿附近加人少量缓冲液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。取下封

5、边的橡皮膏。将凝胶连同托盘放人电泳槽平台上。用缓冲液先填满加样槽，防止槽内窝存气泡。接着再倒人大量pH8.3Tris-硼酸-EDTA缓冲液直至浸没过凝胶面2－3mm。加样将酶解后的DNA样品液与溴酚蓝-甘油溶液以4：1的体积比混合，用微量注射器分别加人到凝胶板的加样槽内。每个糟加10ul左右。因此加样量不宜超过20ul，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品。加样时，注射器针头穿过缓仲液小心插人加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内让其集中沉于槽底部。电泳加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，

6、开始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防上样品扩散。样品进胶后，应控制电压降不高于5V／cm(电压值V／电泳板两极之间距离比)。当染料条带移动到距离凝胶前沿约lcm时，停止电泳。染色将电泳后的胶取出，小心推至0.5ug／ml溴乙锭染色液中，室温下浸泡染色30min。观察与拍照小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，然后再将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长254nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带．荧光在4-6小时后减弱，因此，初步观察后，应立即拍照记录下电泳图谱．观

7、察时应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免紫外光对眼睛的伤害。拍照时，照相机加上近摄圈和红色滤光铺头，用全色胶卷。56光圈，曝光时间根据条带，荧光的强弱进行选择，10-60s。将电泳图谱底片适当放大为照片。制作测量分子量标准曲线在放大的电泳照片上用卡尺测量出λDNA酶解各片段的迁移距离，以DNA酶解各片段分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上连结各点画出曲线，即为DNA分子量的标准曲线。四、注意事项溴乙锭是DNA诱变剂，配制和使用EB染色液时，应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在桌面或地面上。凡是沾污过溴乙锭的器皿或物品，必须经

8、专门处理后，才能进行清洗或弃去。为使DNA完全酶解，需加入适量、足够的酶。太少反应不完全，太多则很费。由于每次购进的酶浓度不可能相同，因此酶和DNA加