紫外-可见分光光度法在核酸分析中应用

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1、紫外-可见分光光度法在核酸分析中的应用摘要综述紫外-可见分光光度法测定核酸总量的方法，总结紫外-可见分光光度法研究核酸与小分子之间的相互作用机理。文中选用上海元析UV6100A紫外可见分光光度计通过实验进行研究！关键词核酸紫外可见分光光度法小分子1.引言核酸是遗传信息的载体，在生物的生长、发育及繁殖等生命过程中起着十分重要的作用。它是以核苷酸为基本组成的生物信息大分子。天然存在的核酸可以分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类。1953年watson和crick[1]提出DNA的双螺旋结构模型，从分子水平上阐述了生命遗传信息通过DNA的半保留复

2、制进行代代遗传的机理，从此生物学进入了分子生物学的新时代。核酸在酶的催化作用下水解为核苷酸。核苷酸完全水解可释放出等量的含氮碱基、戊糖和磷酸。构成核苷酸的五种碱基分别为腺嘌呤(adenine,A），鸟嘌呤(guanine,G），胞嘧啶(cytosine,C），胸腺嘧啶(thymine,T）和尿嘧啶(uracil,U)。其中，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶存在于DNA和RNA分子中，胸腺嘧啶仅存在于DNA分子中，尿嘧啶仅存在于RNA分子中。DNA存在于细胞核和线粒体内，携带遗传基因，决定着细胞和个体的遗传性；RNA存在于细胞质、细胞核和线粒体中，参与遗传信息的复制和

3、表达[2]。因此，它在生命科学的研究中有着无与伦比的重要，其测定具有重要意义。核酸是遗传信息的载体，是基因表达的物质基础。核酸在生物的生长、发育及繁殖等生命过程中起着十分重要的作用。许多药物小分子能与核酸发生相互作用，破坏其模板作用，使核酸链断裂，进而影响基因调控和表达功能[3]。从生物学角度来看，DNA的化学环境就是指DNA周围存在的小分子化合物，研究这些小分子物质与DNA的相互作用，对于认识小分子物质的活性及药物、污染物或毒物在生物体内的作用机理有着极其重要的意义。早在60年代，意大利、法国、日本及美国的一些实验室就开展了有关DNA。蒽环抗生素道诺霉素

4、(daunomycin，DMN)加合物的研究，发现蒽环化合物通过其带正电荷的糖残基与DNA之间的静电作用及蒽环平面与DNA的嵌入结合而形成加合物。道诺霉素的抗癌作用，与其能够和DNA形成加合物也是密切相关的。分子生物学和分子药理学的发展使人们能够从基因水平上理解某些疾病的发病机理，并通过分子设计来寻找有效的治疗药物。DNA靶向化合物成为很重要的药物选择对象。虽然DNA靶向化合物的数量非常之大，但与DNA的结合方式归纳起来可分为非共价结合、共价结合和剪切作用[4,5]三类。(1).非共价作用(可逆相互作用)。这种作用方式受到介质的酸度、离子强度、小分子与DN

5、A的摩尔比等条件的影响，当条件发生改变时，两者作用形式也随之改变，称为可逆的相互作用。A.静电作用。核酸的电负性磷酸根骨架可同阳离子发生静电作用，导致小分子在DNA表面堆积，这种作用是无选择性的。B.沟槽结合模式。DNA双链结构中大沟宽度为1.2nm，小沟宽度为0.6nm，故一些小分子能与DNA大沟或小沟的碱基对边缘直接发生作用。由于大、小沟模区在电势能、氢键特征、立体效应、水合作用上有很大不同，故大分子蛋白质常与DNA的大槽沟结合，而大多数小分子则与小槽沟结合，小分子往往通过腺嘌呤碱基N-3上的氮或胸腺嘧啶碱基C-2上的碳基氧形成氢键而与碱基对结合[6]

6、。C.嵌插结合模式。这种结合模式是指具有平面或几乎平面结构的芳香环嵌入DNA碱基对之间，它的作用力来自芳环的离域Π体系之间的Π-Π相互作用以及疏水相互作用。它是药物小分子与DNA发生作用的重要形式之一。当小分子嵌入碱基对之后，可直接抑制DNA复制与转录。(2).共价作用(不可逆相互作用)及剪切作用。共价结合是指小分子化合物与分子中的原子通过形成共价键而结合的相互作用方式。当小分子与DNA结合形成共价键后，经过一系列化学反应，最终导致DNA断裂，这种现象称为剪切作用。2.用紫外可见分光光度法测定核酸的量核酸、核苷酸及核苷的组成成分中均含有嘌呤、嘧啶碱基，这些

7、碱基都具有共轭双键，因而它们都具有吸收紫外光的特性，能吸收250-290nm波段的紫外光，最大吸收波长在260nm波长处。利用紫外分光光度法定量测定核酸时，规定在260nm波长下，每毫升含1微克DNA溶液的吸光度为0.020，而每毫升含1微克RNA溶的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的A液的吸光度为0.022。利用分光光度法还可以定性鉴定核酸的纯度。蛋白质的最大吸收波长值于280nm。测出样品的A260与A280，从A260/A280260/A280应大于1.8，纯RNA的A260/A280应达到2.0[7]。通常当A值为1时相当于50μg/mL双链DNA

8、。为增强紫外分光光度法测定核酸的准确度，很多人使用有机染料与核酸作