DB 2301∕T 93—2021 高效大豆根瘤菌菌株筛选技术规程(哈尔滨市)

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1、ICS65.020.20CCSB05DB2301黑龙江省哈尔滨市地方标准DB2301/T93—2021高效大豆根瘤菌菌株筛选技术规程2021-11-19发布2021-12-19实施哈尔滨市市场监督管理局发布前言本文件依据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国科学院东北地理与农业生态研究所农业技术中心提出。本文件由哈尔滨市农业农村局归口。本文件起草单位：中国科学院东北地理与农业生态

2、研究所农业技术中心、哈尔滨市农业技术推广总站、黑龙省农业科学院和东北农业大学。本文件主要起草人：严君、王崇生、陆欣春、许艳丽、邹文秀、陈旭、姚玉波、潘凤娟、居瀚寻。I高效大豆根瘤菌菌株筛选技术规程1范围本文件规定了高效大豆根瘤菌菌株筛选技术规程的术语和定义、大豆根瘤菌获得、大豆盆栽根瘤菌复筛、高效大豆根瘤菌田间验证和档案管理。本文件适用于哈尔滨市田间高效大豆根瘤菌菌株筛选。2规范性引用文件列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的

3、引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB3095环境空气质量标准GB15618土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）GB20287农用微生物菌剂NY410根瘤菌肥料NY/T1536微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南NY/T1735根瘤菌生产菌株质量评价技术规范SN/T2632微生物菌种常规保藏技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1高效大豆根瘤菌存活能力强、具有高效固氮能力、竞争结瘤能力，接种后使大豆显著增产的大豆根瘤菌菌株。4大豆根瘤菌获得4.1大豆品种选择选择当地主

4、导大豆品种。4.2大豆根瘤采集在大豆盛花期时，选取叶色浓绿、生长旺盛的大豆植株，将大豆根系挖出带回实验室，用清水冲干净后，选取4至6个新鲜的颗粒饱满、深红色的大根瘤（带部分根）从根部分离。4.3大豆根瘤菌菌株分离与纯化1将采集的根瘤用0.1%升汞溶液表面灭菌3min，无菌水冲洗8次~10次。在无菌条件下，用镊子将根瘤压碎，挤出汁液涂布在根瘤菌琼脂培养基上，26℃~28℃暗培养，快生菌培养3d~4d，慢生菌培养5d~7d，将长出的单菌落采用划线培养法分离。根瘤菌琼脂培养基配方应符合NY410中的规定。4.4大豆根瘤菌

5、菌株确定肉眼观察菌落一致、无杂菌后再纯化1次~2次，即获得纯菌株。根据获得菌株的菌体和菌落特征，可初步确定为大豆根瘤菌，菌体和菌落特征应符合NY410中的规定。将纯菌株在无菌条件下接种于根瘤菌液体培养基中，在180r∙min-1和28℃的恒温摇床中培养至对数生长期，并将供试菌株的菌液在600nm的OD值均调至0.8时作为接种菌液。大豆接种验证：选择当地主导大豆品种。大豆种子表面消毒后催芽，种芽长1mm~2mm时用纯菌株接种液浸泡1min~2min，然后移植到试管根瘤菌琼脂斜面上。设不接种的阴性对照和接种已知菌的阳性

6、对照，每个处理重复≥3次，在20℃~25℃下培养，光强7000lx~8000lx，每天光照时间12h~13h。10d~20d后观察大豆结瘤情况。如不接种的阴性对照结瘤，试验需要重做。空白对照不结瘤，可以判定-5试验没有污染，在10稀释度中70%植株结有效瘤，用刀片将根瘤切开，若根瘤内部为粉红色、红色或褐色为有效根瘤，白色或绿色为无效根瘤，即确定接种菌为大豆根瘤菌菌株。4.5大豆根瘤菌菌株保存大豆根瘤菌菌株保存，应该符合SN/T2632中的规定。5大豆盆栽根瘤菌复筛5.1试验准备蛭石采用间歇性高压湿热灭菌2次，每次1

7、21℃1h，然后置于阴凉通风处2d~3d。盆钵用5%次氯酸钠或0.1%高锰酸钾溶液消毒，并用无菌水冲洗，将灭菌蛭石装入盆钵中，浇适量无菌水备用。选择-9当地主导大豆品种。将4.2中确定的大豆根瘤菌菌株，制备成菌体数量≥1.0×10cfu/mL的接种液，接种液制备应执行NY/T1735的规定。5.2盆栽实施和管理选择当地主导大豆品种。设置空白接种：将已表面灭菌的大豆种子播于灭菌后蛭石中。大豆接种验证（待测根瘤菌接种）：将已表面灭菌的大豆种子在待测根瘤菌接种液中浸泡1min~2min，移植到灭菌后的蛭石中。然后在20℃

8、~25℃下培养，光强7000lx~8000lx，每天光照时间12h~13h。每盆定植1株~2株大豆，不施肥或只施无氮营养液。5.3大豆根瘤菌与大豆品种的共生匹配性和固氮能力检测在大豆初花期，将植株连根取出后用清水洗净，观察根系结瘤情况和根瘤菌的有效性。不接种处理应不结瘤，若结瘤须重新进行盆栽实验。植株样品在105℃下杀青5min~10min，再在80℃下烘至