db22t 2049-2014 动物源性饲料中鸭源性成分测定pcr方法

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1、ICS65.120B46备案号：41837-2014DB22吉林省地方标准DB22/T2049—2014动物源性饲料中鸭源性成分测定PCR方法Determinationofduckderivedmaterialsinanimal-originatedfeedstuffsPCRmethod2014-02-28发布2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布DB22/T2049—2014前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加

2、工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、邴炜、王莹、周亮、吕航、郎乐、张庆波、宫国强。IDB22/T2049—2014动物源性饲料中鸭源性成分测定PCR方法1范围本标准规定了动物源性饲料中鸭源性成分的PCR检测方法，该方法的检出限为0.1%。本标准适用于动物源性饲料中鸭源性成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T274

3、03实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1鸭源性成分duck-derivedmaterials鸭种属特异性DNA片段。4原理对样品进行DNA提取，通过PCR扩增，检测鸭特异性基因片段。5试剂和材料除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1鸭源性成分检测用引物（对）序列为：a)上游引物：5’-CATCTATCCTGCTAGCCGCC-3’b)下游引物：5’-GGCTTGAGTGGAAGAATGCC-3’5.2TaqDNA聚合酶。5.3dNTP：dATP（

4、deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosinatriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。5.4动物基因组DNA提取纯化试剂盒。5.5RNaseA酶：冻干品，不含DNase。5.6蛋白酶K：冻干品。5.7三羟甲基氨基甲烷（Tris）。5.8Tris饱和苯酚。1DB22/T2049—20145.9三水合乙酸钠、氯化钠。5.10十六烷基三甲基溴化铵（c

5、etyltrithylammoniumbromide，CTAB）。5.11乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2·2H2O）。5.1275%乙醇、异丙醇、三氯甲烷、异戊醇、正己烷等有机试剂。5.1310×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾（KCl），15mmol/L氯化镁（MgCl2）。5.14分子量标记：100bp~3000bpDNAMarker。5.15酶切缓冲液：含10mmol/LTris-HCl（pH7.5），10mmol/LMgCl2，50mmol/LNaCl，0.1mg/mLBSA。5.16RNaseA酶

6、溶液：用高压灭菌的去离子水溶解RNaseA酶为10mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。5.17蛋白酶K溶液：用高压灭菌的去离子水溶解蛋白酶K为20mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。5.18乙酸钠溶液，3mol/L：在80mL水中，加入40.81g三水合乙酸钠，溶解后用冰乙酸调节pH值到5.2，用水定容到100mL，分装后高压灭菌。5.19Tris-HCl，1mol/L，pH8.0：在800mL去离子水中溶解121.1gTris，冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。5.20EDTA，0.5mo

7、l/L，pH8.0：称取186.1gEDTA-Na2·2H2O，加入700mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠调pH值至8.0，用水定容到1L，分装后高压灭菌。5.21CTAB提取缓冲液I：在800mL去离子水中加入46.75g氯化钠，溶解后加入1mol/LTris-HCl（pH8.0）50mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）20mL，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠调节溶液的pH值至8.0，用水定容至1L，分装后高压灭菌。5.22CTAB提取缓冲液II：在800mL去离子水中加入46.75g