标准菌株质量控制溯源程序

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1、标准菌株质量控制溯源程序第0版0次修改第1页共0页实施日期:2006.11.081.目的对微生物菌种进行严格管理和使用，为确保量值传递的溯源性、稳定性、统一性、准确性和确保检验数据的可靠性，具有重要作用。2.范围适用于对检定用标准储备菌株和工作菌株的使用和控制，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等3.职责采购人员负责菌种的申购、接收、分发。微生物检验员负责菌种的确认、保存、传代、使用及销毁。4.活动4.1定义标准菌种是指由微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。工作用菌种是指用标

2、准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。4.2申购根据菌种使用情况提出申购需求向微生物菌种保藏中心购买，购买时需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数4.3接收菌种到达实验室后，由检验人员接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《菌种接收记录》（附表1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并储存于2-8˚C直到需要使用时。储存期

3、最长不超过5年。4.4保存4.4.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌：1个月；酵母菌：2个月；霉菌及芽胞：3个月。4.4.2传代用菌种的保存采用甘油冷冻管保藏法、液体石蜡保存法和定期移植法。4.4.2.1甘油冷冻管保藏法用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中

4、的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%），即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在-20℃冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2代（G2），保存期限为5年。使用时，取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏，挑取纯菌落传代或工作用。此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏（如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌）。4.4.2.2液体石蜡保存法无菌液体石蜡的制备：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，在121℃灭菌30分钟,置40℃恒温箱中蒸发水

5、分，经无菌检查后备用。4.4.2.2.1．液体石蜡管的制备：将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件下培养结束后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20℃冷冻冰箱中保存。此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌的保存（如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。4.4.2.2.2各菌种的保存方法、条件及期限，见《传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限》（附件1）。4.4.3定期移植法从标准菌株接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌

6、体，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。该菌种于2～8℃保存。斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失4.5标准菌种的复苏、确认、传代4.5.1.1．标准菌种的复苏4.5.1.1.1．把冻干菌种管、灭菌毛细滴管（1ml）、双碟、镊子、营养肉汤培养基（或其它适宜培养基）数支，移入接种室或超净工作台。4.5.1.1.2．将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将标准菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基

7、），滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。4.5.1.1.3．取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基）少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至营养肉汤培养基（或其它适宜的培养基）内，并根据不同菌种类型而将其培养于相宜的温度下24～72小时（细菌需要24～48的培养物，酵母菌需要72小时的培养物，形成孢子的微生物则宜保藏孢子，放线菌和丝状真菌则应培养7～10天）。最后将毛细滴管及菌种管经高温灭菌（12