牦牛胃蛋白酶原c基因的克隆及序列分析

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1、—36—江苏农业科学2014年第42卷第5期朱小翌，张林，骆美蓉，等．牦牛胃蛋白酶原C基因的克隆及序列分析［J］．江苏农业科学，2014，42(5):36－38．牦牛胃蛋白酶原C基因的克隆及序列分析1，21，22，31，21，21，21，2朱小翌，张林，骆美蓉，江伟华，林忠荔，刘益丽，江明锋(1．动物遗传育种学国家民委－教育部共建重点实验室四川成都610041;2．西南民族大学青藏高原研究院，四川成都610041;3．青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，四川成都610041))摘要:采用ＲT－PCＲ技

2、术，成功获得了牦牛胃蛋白酶原C基因，用ProtParam在线工具对牦牛胃PGC蛋白的基本性质进行测定。结果表明，其相对分子质量为42931．6，pI值为4．45，半衰期为30h，不稳定系数为40．76，总平均亲水性为0．041。对该蛋白的二级、三级结构分析表明，牦牛胃蛋白酶结构与黄牛没有明显区别，均含有5个α－螺旋、25个β－折叠，三维结构也基本一致。关键词:牦牛;PGC基因;克隆;序列分析+中图分类号:TS201．25;Q785文献标志码:A文章编号:1002－1302(2014)05－0036－03酸性蛋白酶

3、是胃蛋白酶、凝乳酶、微生物蛋白酶等的统族羌族自治州红原县;exTaq酶、pGEM－TEasy载体试剂盒、称。目前，酸性蛋白酶被广泛应用于食品工业、饲料添加剂、T4连接酶均购于天根生化科技有限公司;cDNA合成试剂盒［1－5］酿造、皮革制造、医药等行业。国际上研究最多的是胃蛋为Thermo产品。白酶。庞美蓉等研究发现，胃蛋白酶能有效断裂大豆蛋白质中1．1．2引物的设计与合成根据GenBank收录的黄牛的肽键，提高溶解度并且消化抗营养因子，提升了大豆的营养PGC、GAPDH基因序列设计2对引物，序列为PGC－F:5'

4、－［6］ATGAAGTGGATGGTACTGGCCTT－3';PGC－Ｒ:5'－AATA-价值。目前，国内对胃蛋白酶的研究主要集中在采用亚硝基胍、紫外线、辐射等方法进行微生物源产酶菌株的选育。通过AACAGCTCTTCTCCACGTTGG－3';PGC－qPCＲ－F:大肠杆菌、酵母及曲霉表达的重组凝乳酶已经上市，并取得了5'－TGAGGACCTACAAGCACGA－3';PGC－qPCＲ－Ｒ:5'－［7］ATAGCCTAAGATGCCAGTGAG－3';YAK－GAPDH－F:5'－较好的经济效益。目前，学者们主

5、要从猪、牛、羊等动物黏膜中提取胃蛋白酶遗传资源。本研究分析了克隆得到的麦洼牦GACAAGATGGTGAAGGTCGGA－3';YAK－GAPDH－Ｒ:5'－牛胃蛋白酶原C基因(PGC)的结构，旨在为研究青藏高原特有TTACTCCTTGGAGGCCATGTG－3'。引物由上海生工生物工动物牦牛的基因资源并拓宽工程胃蛋白酶来源提供依据。程技术服务有限公司合成。1．2方法1材料与方法1．2．1牦牛复胃组织总ＲNA的提取按照试剂盒说明书用1．1材料TＲIzol法提取牦牛复胃总ＲNA，测量其D260nm/D280nm值，1

6、．1．1材料与试剂牦牛复胃组织样品采自四川省阿坝藏－80℃密封保存备用。1．2．2cDNA的合成、扩增和回收目的基因以牦牛复胃总收稿日期:2013－11－08ＲNA为模板，使用Thermo反转录试剂盒，合成牦牛复胃基金项目:国家自然科学基金(编号:31172198);教育部科学技术研cDNA。以上述反转录cDNA为模板，PGC－F、PGC－Ｒ为引究重点项目(编号:2102654);西南民族大学中央高校基本科研业物，扩增PGC基因。PCＲ反应条件为:95℃1min;95℃务费专项(编号:2014NZYQN59);留

7、学归国人员项目;西南民族大30s，60℃30s，72℃30s，30个循环;72℃5min。PCＲ反学2013年研究生创新型科研项目(编号:CX2013SZ64)。应体系:cDNA模板1．5μL，PrimerF(10μmol/L)1μL，Primer作者简介:朱小翌(1989—)，男，湖北洪湖人，硕士研究生，从事遗传Ｒ(10μmol/L)1μL，EXTaqDNA聚合酶0．2μL，dNTP混合学研究。E－mail:604417607@qq．com。物1μL，Mg2+2μL，加ddHO至20μL体系。PCＲ产物经2通信

8、作者:江明锋，博士，教授，从事遗传学研究。E－mail:1%Agarose电泳检测后，用DNA凝胶回收试剂盒回收PCＲmingfengjiang@vip．sina．com。片段，并用0．7%Agarose电泳检测胶回收片段。櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄［4］王振金，王建民，王桂芝，等．崂山奶山羊骨桥蛋白基因(