绿盲蝽膜结合型海藻糖酶altre-2基因表达、纯化及酶学特性

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1、棉花学报CottonScience2013袁25渊5冤院396~402绿盲蝽膜结合型海藻糖酶-2基因表达尧纯化及酶学特性*谭永安袁肖留斌袁柏立新袁孙洋渊江苏省农业科学院植物保护研究所袁南京210014冤摘要院以绿盲蝽为材料袁在前期获得绿盲蝽膜结合型海藻糖酶(ALTre-2)基因的基础上袁构建了-2原核表达载体渊pET28a--2冤袁经IPTG诱导表达尧变性尧复性和蛋白纯化后袁获得具海藻糖酶活力的重组蛋白袁最后在以海藻糖为底物及重组蛋白浓度为1.1mg窑mL-1的条件下袁对纯化得到的重组ALTre-2蛋白进行活性检测袁确定了其酶促反应的最佳pH和最适

2、温度遥试验结果表明院-2基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够高效表达一个约60kD大小的蛋白袁SDS-PAGE显示该蛋白以包涵体形式存在袁经变性尧复性及蛋白纯化获得了具海藻糖酶活力的重组蛋白曰该重组ALTre-2蛋白在pH为7.0时活性最高袁同时重组ALTre-2蛋白酶活性最适温度是50益遥研究结果为深入探讨绿盲蝽膜结合型海藻糖酶分子调控机制奠定基础遥关键词院绿盲蝽曰膜结合型海藻糖酶曰原核表达曰酶学特性中图分类号院S435.622文献标志码院Ａ文章编号院1002-7807(2013)05-0396-07*TANYong-an,XIAOLiu-bi

3、n,BAILi-xin,SUNYang渊210014,冤UsingapreviouslyobtainedcDNAsequenceencodingamembrane-boundtrehalasefrom,apET28avectorcontaining-2genewasconstructedandtransformedintoBL21competentof.Thetargetrecombinantproteinwasoverexpressed,andpurifiedusingNi-NTA(Nickel-nitrilotriaceticacid)agar

4、ose,andthenitsactivityandenzymaticcharacteristicswerestudied.Theresultsshowedthatthe-2genecouldbeoverexpressedin,andthetargetrecombinantproteinhadahighertrehalaseactivity(84.747依3.299nmol窑滋g-1窑min-1)whenusingtrehaloseassubstrates;themostsuitablereactiontemperaturewas50益,andthe

5、idealpHwas7.0.Ourresultsfacilitatefurthermolecularresearchonthemembrane-boundtrehalasefrom.;membrane-boundtrehalase;prokaryoticexpression;enzymaticcharacteristic绿盲蝽(Hemiptera:Miri-控技术遥对昆虫重要代谢酶重组蛋白及其酶学特[1]dae)是棉花的重要害虫袁它不仅刺吸棉花生长点性的研究袁不仅可以用于阐明基因功能袁还可开形成野无头苗冶袁还可影响叶片尧蕾和花的正常生辟针对性的害虫

6、酶抑制剂防控新途径遥长袁形成野破叶疯冶等症状袁造成棉花产量和品质海藻糖酶是专一性将昆虫体内海藻糖水解[2][7]的巨大损失遥良好的越冬环境尧充足的营养条件成为葡萄糖的代谢酶遥根据是否存在跨膜结构以及日渐温暖的气候袁对绿盲蝽生长繁殖和越冬或潜在跨膜结构袁可将昆虫海藻糖酶分为可溶性[3-4]存活非常有利袁杀虫频次及剂量的减少使绿盲海藻糖酶渊Solubletrehalase袁Tre-1冤和膜结合型海[5-6][8]蝽种群数量逐年增多遥因此袁目前绿盲蝽防控藻糖酶渊Membrane-boundtrehalase袁Tre-2冤遥面临严峻挑战袁需开拓新配方或新靶

7、标的有效防Tre-2是一种跨膜蛋白袁主要水解食物中的海藻收稿日期院2013-05-16作者简介院谭永安渊1982-冤袁男袁硕士袁助理研究员袁kellytan001@163.com曰*通讯作者袁jaasblx@jaas.ac.cn基金项目院公益性行业渊农业冤科研专项渊201103012冤曰现代农业产业技术体系建设专项资金曰国家科技支撑计划项目(2012BAD19B05)5期谭永安等院绿盲蝽膜结合型海藻糖酶-2基因表达尧纯化及酶学特性397[9]糖袁在昆虫飞行尧肌肉运动和取食阶段中肠等生-2基因在原核细胞中进行高效表达袁进而[10]理活动中发挥作用袁同

8、时Tre-2也影响昆虫中通过变性尧复性及纯化获得具海藻糖酶活性的重[11]肠几丁质的合成袁因此袁膜结合型海藻糖酶已成组蛋白