西瓜抗病基因同源序列的克隆与分析

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1、西瓜抗病基因同源序列的克隆与分析奚玉培，谢新蕊，高 强，张志忠（福建农林大学园艺学院，福建福州350002）摘 要：以植物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类(STK)抗病基因产物催化结构域Ⅰ的保守氨基酸序列设计简并引物，以西瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到大约500bp的目的条带。重组质粒经PCR检测后进行测序，获得1个有效序列，可以编码完整的氨基酸序列。同源性分析表明其具有STK保守结构域，与已经克隆的Pto、Lr10和Lectin等基因在氨基酸水平上的同源性为40.0%～54.0%。关键词：西瓜；抗病

2、基因同源序列；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STK)西瓜[Citrulluslanatus…(Thunb.)]栽培历史悠久，分布物：R1：5'-TTC/TGGIA/G/TIIGTITAC/TA/CA/GIGG-广泛，经济价值巨大。据联合国粮农组织(FAO)统计是世3';R2：5'-AC/TICCA/GA/TAAIC/G…A/TA/GTAIAC/[1]界第五大果品，我国是西瓜最大的栽培和消费国。近年来TA…/GTC-3'。以西瓜基因组DNA为PCR扩增模板，反西瓜栽培连作现象日趋严重，病害逐年加重，产量和品质下

3、应体积25…μL，内含2.5…μL…10×Ex…Taq酶缓冲液，2μL…降，经济损失巨大。目前控制病害的主要措施是嫁接和化学dNTP(2.5…mmol/L)，引物1和引物2(10…mmol/L)各0.5…μL，防治，嫁接会对品质产生一定影响，同时需不断筛选砧木，0.5μL…Ex…Taq…DNA聚合酶。反应条件为94℃预变性…而农药使用易引起病源抗药性并污染环境，在高温高湿地区5…min，此后进行94℃30…s、45℃40…s、72℃1…min的35个防治效果不佳。培育抗病性强的新品种是解决这一问题的最循

4、环，72℃延伸10…min。PCR产物经电泳检测回收目的片段，根本措施，但西瓜遗传基础狭窄，抗病资源缺乏，抗病性遗连接pMD18-T载体，测序。[2]1.2.3 西瓜RGAs生物信息学分析 西瓜RGAs生物信息传规律复杂，常规抗病育种进展缓慢。利用植物抗病基因工程技术有望解决这一问题，其首选的最佳目的基因是来自学分析利用DNAMAN…6.0和Blast进行。[3]植物自身的抗病基因(R基因)。现已克隆到玉米、番茄、2 结果与分析烟草等植物的有关抗病基因。一旦分离克隆到R基因，就2.1 西瓜RGAs的获得

5、可把它导入其他品种或植物中获得对特定病原菌的抗性。西试验中以西瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增得到瓜R基因克隆工作起步较晚，目前只克隆到1个和枯萎病1条大约500…bp的条带(见图1)。目的条带回收后连接入抗性相关的基因Fom-2，对枯萎病原菌0和1型生理小种有载体，随机选择15个经PCR检测的阳性克隆进行测序，[4,5]专化抗性，其他抗病功能基因的克隆尚未见报道。本试获得3条有效序列，经DNAMAN软件分析其中1条可以验根据在其他植物中已有报道的R基因中STK类保守结构编码完整氨基酸序列。域设计简并

6、引物，克隆西瓜抗病基因同源序列(RGAs)，有望从中筛选出和西瓜抗病紧密相关的基因，为利用抗病基因工程改良西瓜提供理论依据和基因来源。1 材料与方法1.1 材料以西瓜品种‘新红宝’(Cucumismelocv.’XinHongBao’)叶片为材料。1.2 方法1.2.1 西瓜基因组DNA的提取 西瓜基因组DNA提取采[6]用CTAB法。图1　STK类R基因简并引物扩增西瓜基因组DNA产物1.2.2 西瓜RGAs的克隆 根据目前已克隆的STK类R基2.2 西瓜RGAs的比较和聚类分析因产物的催化结构域Ⅰ和

7、Ⅸ的保守氨基酸序列设计简并引Blast初步分析显示序列具有ATP结合部位、底物结合部位和激酶结构域的活化环(A-loop)等，属于典型的蛋白激酶基因家族，可能是STK蛋白激酶类R基因同源第一作者简介：奚玉培（1987－），女，硕士研究生；研究方向序列片段。将获得的西瓜RGAs序列与目前具有代表性的为蔬菜遗传育种与生物技术。STK类R基因番茄抗假单孢菌基因Pto(U59316)、小麦抗通讯作者：张志忠，副教授。E-mail:zeada2001@163.com。叶锈病基因Lr10(U51330)和拟南芥外源

8、凝集素蛋白激酶类项目来源：福建省自然科学基金“西瓜一号染色体分子标记筛选基因Lectin(AB017067)的氨基酸序列进行同源性分析，均和R基因的克隆”(2011J01083)。含有STK类R基因的9个保守结构域(见图2)，为STK-32-中国园艺文摘 2013年第12期类候选抗病基因类序列，同源性在40.0%～54.0%之间。3 讨论由R基因控制的防卫机制已经成为广泛研究的重点。大多数已报道的R基因氨基酸序列存在很多保守区域，如[7]L