抗寒基因ice1转入烟草研究

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1、抗寒基因ICE1转入烟草研宄缪嘉航(安徽中烟芜湖卷烟厂安徽芜湖241000)【】通过PCR的方式从拟南芥中扩增得到ICEI目的基因，将ICEI基因连接到PMD18T载体中，再采用双酶切的技术将AtICEI基因连接到植物表达载体PCAMBIA1301上构建pLC2015植物表达载体，利用农杆菌介导的方式将PIC2015载体转入烟草中，经过PCR和抗寒性实验检测，结果表明ICEI基因已成功转入烟草中，并具备一定的抗寒性。【关键词】抗寒性；ICEI;转基因烟草【】Q812【文献标号】A【】2095-9753(2016)3

2、-0239-02Abstract:AmplifyfromarabidopsisthalianabymeansofPCRtogetthetargetgeneofICEI,connecttheICEIgenetothecarrierofpMD18T,usethedoubleenzymedigestiontechnologytoconnectAtICEIgenetotheplantexpressionvectorofpCAMBIA1301inordertobuildtheplantexpressionvectorofpL

3、C2015,andtransformthecarrierofpLC2015intotobaccobywayofagrobacteriummediatedtransformation.AfterthedetectionofPCRandcoldresistanceexperiment,theresultshowsthatICEIgeneshavebeensuccessfullytransferredintotobaccoandareofcertaincoldresistance.Keywords:coldresista

4、nce;ICEI;transgenictobacco温度能够对植物的生长、发育、繁殖产生强烈的影响。低温可能会使植物无法存活而拥有抗寒性的楨物则能在低温环境中正常的存活。每年都有大量因低温死亡的农作物，对全球的经济造成了巨大的损失。植物冷驯化是指长期处于低温环境中的植物会发生一系列特异性的突变来顺应环境，增强植物的抗冻能力。目前，楨物冷驯化的分子调控机制方面的研究已经取得了丰富的成果。转录因子CBF/DREB1(Crepeatbindingfactor/dehydrationresponsiveelementbin

5、dingprotein)会在低温环境中加快表达速度，促进下游大部分基因的表达，在植物冷驯化过程中发挥着关键作用。ICEI(inducerofCBFexpression1)是转录因子CBF的上游转录调节因子，能够和CBF中MYC顺式作用元件相互结合激活CBF3基因，进而激活大量的下游基因表达。本研究采用农杆菌介导将拟南芥的ICE1基因转入到烟草中，期望在不影响烟草正常生长、发育的基础上，增强烟草的抵御低温的能力，并利用转基因技术培育具有抗寒能力的烟草打下坚实的基础。1材料和方法1.1材料将拟南芥(Arabidopsi

6、sColumbiaecotype)的种子洗浄，浸泡于75%的乙醇中消毒5min，再用无菌水冲洗5次，接种于1/2MS分化培养基中培养，设置温度为25°C，光照强度为4000IX,光照12放置于组培室培养。将烟草(Nicotianatobacum)种子取出，浸泡于75%乙醇中消毒5分钟，在置于0.1%的升汞中消毒15min，火菌水淋洗5次，接种于1/2MS分化培养基中，设置温度为25°C,光照强度为4000IX,光照12放置于组培室培养。1.2方法1.2.1获取AtICEl基因从出苗10d左右的拟南芥叶片中提取总RN

7、A,并作为模板，以Olig(dT)18为引物进行反转录，然后取适量反转录获得的cDNA为模板以ICElf：5′-CCATGGTCACGTGGATCATACCAGCATAC-CCTGCT-3′(Ncol酶切位点)和ICE1r:5′-CCATGGGTCTTGACGGAAACAATGGT-3′(Acvl酶切位点)为正反引物，使用TaqDNA聚合酶进行PCR反应，对PCR得到产物进行冋收，经过纯化之后与PMD18载体连接，然后进行测序。1.2.2AtlCEl基因植物表达载体的

8、构建对测序结果正确的pMD-AtICEl重组质粒以及购买的PCAMBIA1301植物表达载体进行双酶切，两种酶分别为Ncol和Acvl,对酶切产物进行冋收纯化，将AtICEl基因连接到pCAMBIA1301载体上，扩增质粒，提取、经酶切鉴定、测序确定。即成功构建35S启动子AtICEl表达载体，并将其命名为PYC2015。1.2.3重组载体的转入烟草将含冇P