大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

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1、维普资讯http://www.cqvip.com中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2007，27(9)：103～109大肠杆菌高效表达重组蛋白策略木任增亮堵国成陈坚吴敬(1食品科学与技术国家重点实验室江南大学无锡2141222江南大学生物工程学院无锡214122)(3江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122)摘要大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早和目前应用最广的经典表达系统。利用该系统表达重组蛋白具有许多优越性，但其表达效率受诸多因素的影响。综述了国内外利用大肠杆菌表达系

2、统高效表达外源蛋白的策略，主要包括选择合适的启动子、改变信号肽结构、提高mRNA稳定性、提高翻译效率、表达稀有密码子、降低包涵体形成及蛋白降解，利用融合蛋白与分子伴侣、调控发酵条件实现高密度培养等。关键词大肠杆菌基因工程重组蛋白克隆表达中图分类号Q786表达重组蛋白受许多因素的影响。如菌体生长特过量表达外源蛋白尤其是对细胞有毒性的蛋白会严重性，基因转录水平，产物到达部位，翻译后修饰过程以抑制菌体生长而使蛋白总表达量下降；(3)启动子的诱及蛋白的修复调控等⋯。虽然一些含复杂二硫键结构导要求简便而廉价。现在比较常

3、用的是温度诱导和或者来源真核生物需要翻译后修饰的蛋白，不能利用IPTG诱导(表1)。IPTG诱导主要应用于基础性研E．coli系统得到高效表达而选择植物细胞、哺乳动物究，由于其毒性和价格昂贵而不能用来生产人类药用细胞组织和其它微生物宿主，但是大肠杆菌具有遗蛋白。所以限制了tac和trc启动子的广泛应用。温控传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易型诱导方式简单而且廉价，另外也有改造的启动子如纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等优突变的lac启动子，利用温度或IPTG都可以诱导。点，是基因表达

4、技术中发展最早和目前应用最广泛sD序列在起始序列上游5～13bp处，可以消除的经典表达系统，迄今已有大量有关该系统高效表mRNA的电势而提高转录效率。RBS的3和5端都富达重组蛋白的研究⋯。含嘌呤碱基。抗生素标记主要用来筛选重组子和提供选择压，氨苄青霉素抗性标记最常用，但是在生产人1表达载体的构建类药用蛋白时要考虑其它抗性标记，防止用药过程中表达载体的构建是实现高效表达的关键步骤。一出现对青霉素的过敏反应。表达载体拷贝数决定于个完整表达载体包含必需的几个元件(图1)。启动子复制起点；使用强启动子和高拷贝质粒会

5、降低宿主细位于转录起始位点上游一10bp～35bp，受载体自身或胞的存活力而最终不一定能提高目的蛋白的产量。宿主染色体相应的调节基因调控。一个理想的启动子Kim等¨在目的基因上游使用双启动子，有效提高了需要具备如下特点：(1)具有强启动性，使重组蛋白达表达量。到菌体表达蛋白总量的10％～30％；(2)必须受调节基因严谨调控。在一定菌体浓度下开始诱导表达，否则，收稿日期：2007-07—19修回日期：2007-o8-21教育部新世纪人才计划资助项目(吴敬)，江苏省自然科学基金资助项目(BK2007019)}}通

6、讯作者，电子信箱：jingwu@jian~an．edu．cn维普资讯http://www.cqvip.coml04中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo1．27No．92007R]Tf-I16SrRNA3，¨(，A1lLICC1ICCGUG(8％)IILIGf1％)图1原核表达载体的主要元件组成简图箭头所指为转录方向。在核糖体结合位点(RBS)中有sD序列，富含嘌呤，该序列与核糖体16SrRNA的3一端互补配对，促使核糖体结合到mRNA上，有利于翻译的起始。RBS的结合强度取决于SD序列的结

7、构及其与起始密码AUG之间的距离，SD与AUG之间相距一般以4～lO个核苷酸为佳。阻抑物由调节基因编码，调节基因位于载体或者整合在染色体上。转录终止子(TT)保持mRNA的稳定性。复制起点Of决定质粒拷贝数Fig．1Schematicpresentationofthesalientfeaturesandsequenceelementsofaprokaryoticexpressionvector表1E．coli常用启动子及特点Table1Promotersusedforthehigh·levelexpressi

8、onofgenesinE．coli酶识别。2信号肽的结构对分泌功能的影响现在有大量信号肽可供选择，如来自E．coli的重组蛋白向大肠杆菌的周质空间和胞外分泌都需ompA，phoA，ompF，ompT，lamB；来自金黄色葡萄球菌的要一段大约15～30个氨基酸的信号肽引导蛋白质的A蛋白；来自胡萝卜软腐欧文氏菌的pelB以及人类生转运。研究发现典型的信号肽序列N一端一般含有2～长激素的信号肽等。将人类3