文献阅读_人造生命

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1、日期：2012年10月19日创造由化学合成基因组控制的细菌细胞2010年5月20日，美国科学杂志上有一篇研究论文名为“创造由化学合成基因组控制的细菌细胞”，其内容摘要为：克雷格·文特尔私人研究机构从基因测序信息数据化开始，报道含有1,080,000个碱基对的蕈状支原体JCVI-syn1.0基因组的绘制、合成和组装，并且把它移植进一个山羊支原体受体细胞中，创造一个仅仅由（化学）合成的染色体组控制的新的蕈状支原体细胞。该细胞中，唯一的DNA就是那有计划合成的DNA序列，包含“水印”序列和其他在构建过程中所需

2、的基因删除、多态性和变异。背景：作者表示，此前科学界对基因组，尤其是基因组的功能，知之甚少。自从1977年桑格（Sanger）及其同事确定了噬菌体φX174的完整基因密码，即世上第一个DNA基因组完整测序成功以来，生物基因组的测序成果呈指数型增长，从而产生了数不清的基因组信息数据。然而，即使一个单细胞系统的基因及其对应生物功能都还没有搞清楚。因此，作者提出了一个研究思路：在简单的单细胞生物细菌中，染色体是否已经包含正常生命活动所需的全部指令？如果真是这样的话，能否将计算机中的基因组序列用化学合成的方法得

3、到一个能够复制的完整基因系统？整个团队用了15年时间，致力于人工合成DNA大分子和染色体，并用来构建一个最小的只是包含必需基因的细胞。他们选用的含有已知生物中最小基因组的单细胞生物——生殖支原体，它的485个编码蛋白质的基因中有超过一百个不是必要的。他们最终得到了“由化学合成基因组控制的细菌细胞”。然而，他们的研究并不是一帆风顺的。在当时，人工化学合成只能得到平均6kb大小的DNA片段，如何将这些小片段组装起来得到DNA大分子呢？他们研究得到一种方法：将化学合成的全部DNA小片段导入酵母菌中利用同源重组

4、拼接成大片段，多次进行最终得到完整的基因组。其中，还需利用大肠杆菌扩增、筛选。然而，将化学合成的基因组移植进受体细胞并成功表达也有不少的障碍。例如，如何完整地从酵母菌中提取出染色体？如何将合成的基因组移植进受体细胞，并且建立一个仅由外来基因组控制的细胞？而且，生殖支原体的生长速率及其缓慢。研究团队重新选择了生长比较快的蕈状支原体作为基因组供体，山羊支原体作为人工合成的基因组受体作进一步研究。尽管克服了上述困难，在移植蕈状支原体天然DNA的时候，他们成功地得到了完全由蕈状支原体基因组控制的山羊支原体，但为

5、什么改用化学合成的蕈状支原体基因组会导致失败呢？研究继续进行，他们最后发现蕈状支原体和山羊支原体共用一套“抵御系统”，天然的蕈状支原体基因组已经被甲基化，能够使该基因组被山羊支原体接受。因此，化学合成且在酵母菌中拼接而成的基因组需经过甲基化酶修饰。研究结果最终证明，在简单的单细胞细菌中，染色体上有其正常生命活动所需的全部指令信息。主要研究结果：实验步骤简单概括为如下4个方面：1)合成供体的基因组DNA：首先，将蕈状支原体的全基因组测序，并按照该序列信息将其合成为1078条平均长度为1080bp的DNA片

6、段。这些片段两两间具有80bp的部分重叠，所有片段拼接起来构成蕈状支原体的全长基因组。值得注意的是这些合成的片段较天然基因组略有一些改动，包括去除了14个不重要的基因、为阻断基因而设计的两个插入序列、27处单核苷酸多态性(其中19处在意料之中)以及4条用来区分于天然序列模本的“水印”标记，这些改动都不影响细胞正常的生命活动。该过程涉及到计算机对合成序列的精密计算。2)合成DNA片段的拼接：将以上合成的1078条DNA片段分别连接到载体，使其能在酵母细胞中通过同源重组拼接起来。于是，平均1080bp的DN

7、A片段，10个一组拼接为大约10kb的片段(109个)，然后将这些连接有目的基因片段的载体从酵母中分离出来，转入大肠杆菌E.coli中进行扩增，以限制酶筛选出阳性克隆；之后再将阳性克隆质粒中的这109条10kb左右的片段按同样的方法每组10个拼接成100kb的片段(11个)；这11条片段最终拼接成完整的总共1077947bp的基因组(由于携带太大片段的载体在E.coli中不能稳定传代，因此后两步拼接中采用多重PCR来筛选阳性克隆)。此过程除了2个衔接反应是在体外用酶处理构建，其余所有的片段都是在酵母细胞

8、内依靠同源重组拼接而成。3)人工基因组的甲基化修饰：由于供体细胞(蕈状支原体)和受体细胞(山羊支原体)共用同一套限制酶系统，而天然的供体基因组是经甲基化修饰的。因此，拼接完成的基因组DNA还需在体外用甲基化酶(从蕈状支原体或山羊支原体提取物中纯化)进行修饰，以避免受体细胞限制酶系统的阻碍。4)人工基因组移植入受体细胞：将构建好的人工合成基因组移植入山羊支原体内。细胞经过不断分裂传代，具有人造基因组的细胞在含抗生素的培养基中筛选出来，同时含有