apoe基因敲除对骨髓造血干细胞的影响分析

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1、ApoE基因敲除对骨髓造血干细胞的影响分析　　载脂蛋白E(apolipoproteinE，ApoE)是一种多态性蛋白，参与脂蛋白的转化与代谢过程，其基因可以调节多种生物学功能。ApoE基因敲除后，小鼠的B淋巴细胞及T淋巴细胞发生改变，ApoE在造血干祖细胞中表达丰富，ApoE基因敲除小鼠喂饲高脂、高胆固醇饲料后，造血干祖细胞显着增多，这说明在高脂、高胆固醇可以诱导ApoE基因敲除小鼠造血干祖细胞增殖。那么在没有高脂、高胆固醇诱因下，ApoE基因对小鼠造血干祖细胞有没有影响呢?　　造血干细胞是所有成熟血细胞维持的重要因素。在生理状态下，造血干细胞面临多种命运选择:自我更新、分化、凋亡、静息或迁移

2、，这些选择之间的平衡决定了造血干细胞的功能。不同命运的选择是由内在(细胞周期、凋亡等相关基因)和外在(微环境)的调控机制共同决定的。但是造血干细胞维持自我更新和选择分化的具体机制还不清楚。　　那么ApoE对造血系统有怎样的作用，是否会影响骨髓造血干细胞(hematopoieticstemcell，HSC)的发育分化呢?为了解ApoE基因敲除是否会影响HSC，我们应用ApoE基因敲除小鼠及同窝野生对照小鼠进行了相关分析。　　1材料和方法　　1.1动物与设备　　ApoE基因敲除小鼠来自北京协和医学院比较医学中心，遗传背景为C57B6/L，对照小鼠为同窝野生型小鼠，动物生产及使用许可证号:SCXK(

3、京)2009－0007;SYXK(京)2011－0022。动物饲养在SPF动物房，喂饲SPF级小鼠维持饮料。主要实验设备为美国BD公司Aria流式细胞仪。　　1.2PCＲ方法鉴定ApoE基因敲除小鼠基因型　　用10日龄小鼠尾尖提取基因组DNA，普通PCＲ鉴定基因型。反应条件:94℃预变性3min;94℃30s，68℃30s，72℃30s，35个循环;72℃延伸10min。基因敲除小鼠的PCＲ鉴定引物:OIMＲ0180:5`GCCTAGCCGAGGGAGAGCCG3`，OIMＲ0181:5`TGTGACTTGGGAGCTCTGCAGC3`，OIMＲ0182:5`GCCGCCCCGACTGCATC

4、T3`，PCＲ产物长度，野生型为155bp，ApoE敲除为245bp，杂合子同时有上述2条片段。引物由上海英骏生物工程技术有限公司合成，PCＲ试剂购自宝生物工程有限公司。　　1.3流式分析　　小鼠2月龄时脱颈椎处死，取外周血、胸腺、脾脏、后肢骨，置于冰上预冷的染色缓冲液(含1%BSA的PBS)中。胸腺、脾脏用磨砂玻片研磨成细胞悬液;后肢骨用5mL注射器将骨髓细胞冲出，并吹打成细胞悬液。将细胞悬液用50μm尼龙滤膜过滤后收集到15mL离心管中，用PBS定容至10mL，混匀后，取10μL细胞悬液，稀释10倍后计数细胞数。细胞悬液离心，1000r/min，10min，将细胞浓度调整为11

5、08个细胞/mL。分别取106细胞标记荧光抗体(BD公司)。　　骨髓造血干细胞的分析中用如下抗体进行标记:CD34-FITC、Flt3-PE、CD16/32-Pcrcp-cy5.5、Sca1-PE-Cy7、cKit-APC、Ter-119-Biotin、Gr-1-Biotin、Mac-1-Biotin、B220-Biotin、IL-7Ｒ-Biotin、CD4-Biotin、CD8-Biotin、Biotin-APC-Cy7。骨髓造血干细胞(HSC)表面标记为:lin-c-kit+sca1+，长期造血干细胞(LT-HSC)表面标记为:Lin-c-Kit+Sca1+CD34-Flt3－，短期造血干

6、细胞(ST-HSC)表面标记为:Lin-c-Kit+Sca1+CD34+Flt3－，髓系祖细胞(MP)表面标记为:Lin-c-Kit+Sca1－，共同髓系祖细胞(CMP)表面标记为:Lin-c-Kit+Sca1－CD34+CD16/32loin;加1mL染色缓冲液，离心，2600r/min，5min，弃上清，加200μL染色缓冲液重悬细胞，用50μm尼龙滤膜过滤，冰上避光备用。　　1.4统计分析方法　　数据分析采用SPSS13.0软件包进行统计分析，各组数据均采用x珋±s表示。组间资料分析采用t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。　　2结果　　2.1PCＲ鉴定结

7、果　　剪取10日龄小鼠脚趾，采用饱和氯化钠法提取小鼠基因组DNA，进行PCＲ，产物经2%琼脂糖凝胶电泳，野生型产物长度为155bp，ApoE缺失产物长度245bp。基因型鉴定结果(图1)。　　2.2ApoE基因敲除小鼠外周血B细胞、T细胞减少　　我们取ApoE基因敲除小鼠及同窝野生对照小鼠的外周血进行分析，发现ApoE基因敲除小鼠外周血中B220+细胞(P＜0.05)及T淋巴细胞(P＜0.01)显