鼠疫耶尔森氏菌caf1 和ph6 基因的研究

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1、鼠疫耶尔森氏菌caf1和pH6基因的研究　　鼠疫(plague)是一种烈性的细菌性传染病，历史上的3次世界性鼠疫大流行曾给人类社会带来深重的灾难。我国存在着世界上面积最大、最为复杂多样的鼠疫自然疫源地，其中，新疆就存在五大类型鼠疫自然疫源地。近20年来，我国每年都有动物间鼠疫流行，而且逐渐向城市逼近。因此，面对形式如此复杂而涉及区域广泛的鼠疫疫情，选择恰当、科学的鼠疫诊断方法是非常关键的。F1是鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis，以下简称鼠疫菌)的特异性基因，是由鼠疫菌特有的大质粒pMT1上的caf基因簇编码的

2、一种特异性荚膜蛋白和毒力蛋白。pH6抗原是由染色体编码的鼠疫菌和假结核菌产生的一种表面蛋白质。2014年本文选择这两种鼠疫菌重要功能蛋白caf1及pH6进行克隆表达，为鼠疫潜在诊断靶点奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1DNA模板以鼠疫菌云南玉龙株(D106004)DNA为模板。　　1.1.2质粒载体及基因工程菌质粒pET32a+(Novagen)，感受态细胞E.coliBL21(DE3，TaKaRa)。　　1.1.3主要试剂及材料PCR反应所需试剂，蛋白分子量标准(BIO-RAD公司)，DNA产物纯化

3、试剂盒(QIAGEN)，质粒提取试剂盒(天根)，EasyPAGEKit(Genstar)，限制性内切酶BamHI、XhoI(Biolabs)，T4DNA连接酶(Promega)，IPTG(BioBasicINC)。　　1.1.4实验仪器凝胶成像分析系统、PCR扩增仪、SDS-PAGE电泳仪以及核酸蛋白测定仪均购自Bio-Rad公司，温控摇床，金属浴等。　　1.2实验方法　　1.2.1选取蛋白经查阅文献及基因比对，选择鼠疫菌重要功能蛋白caf1及pH6(去除信号肽)进行克隆表达。　　1.2.2设计引物利用软件Primer5

4、.0对选取的欲表达蛋白编码的基因序列进行引物设计，由上海生工合成。　　1.2.3目的基因的扩增以玉龙株D106004DNA为模板进行PCR扩增目的基因，凝胶成像仪拍照。　　1.2.4电泳鉴定及产物纯化使用DNA纯化试剂盒对阳性产物纯化回收，用NanoDropND-1000进行核酸浓度检测。　　1.2.5质粒的提取用化学转化法将PET-32a+转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，LB液体培养基37℃培养，待OD值约为2.0时，提取质粒备用。提取的质粒做1%琼脂糖凝胶电泳，紫外观察。　　1.2.6PCR产物与质粒的

5、双酶切将PCR纯化产物与载体质粒分别进行酶切，37℃过夜。　　1.2.7PCR产物与载体质粒的连接用DNA纯化试剂盒纯化，将酶切后的目的基因和载体质粒进行连接。　　1.2.8转化采用化学转化法(即氯化钙法)将连接产物转入感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，涂在含Amp100μg/ml的LB培养基平板上进行阳性克隆子的筛选。　　1.2.9阳性克隆子的筛选与鉴定包括PCR扩增鉴定、双酶切鉴定和重组质粒测序鉴定，收集菌液，-80℃冰箱保存。　　1.2.10重组蛋白的诱导表达将阳性克隆子接种于含Amp的液体培养基中

6、，37℃下220rpm3～4h，至OD值为0.3～0.4时，吸取1ml菌液作为诱导前对照，向剩余菌液中加诱导剂IPTG(终浓度为1mmol/L)37℃下160rpm，诱导4h。　　1.2.11电泳分析将诱导后及诱导前菌液均进行SDS-PAGE电泳。恒压电泳，积层胶80V30min，使用1%考马斯亮蓝染色、脱色，在成像仪下进行分析。　　2结果　　2.1目的基因片段的扩增caf1为鼠疫耶尔森菌的特异性基因，在鼠疫菌基因组中十分保守、特异;而pH6基因与假结核耶尔森菌的相关基因有极高的同源性，为属特异性基因。设计扩增引物时，在

7、每个基因上下游引物的5'端均添加了合适的限制性内切酶酶切位点及2～3个保护碱基。通过优化PCR反应条件，最终获得了非常满意的扩增结果。　　2.2重组质粒的双酶切鉴定结果，酶切后的目的基因片段大小与PCR扩增结果一致，。　　2.3重组质粒的序列分析鉴定采用T载体通用引物进行测序，以PET-pH6为例，与已公布的pH6基因序列进行比对，。　　2.4重组蛋白的诱导表达结果重组鼠疫相关蛋白rpH6、rcaf1均有较好表达，与理论分子量34.2ku、35.5ku的理论分子量一致.　　3讨论　　鼠疫被列为甲类传染病，针对该病

8、病原检测方法的准确性与及时性对鼠疫防治工作的总体水平与成效都至关重要，任何的误诊、漏诊都有可能成为一桩严重的公共卫生事件。随着分子生物学技术的发展，多株鼠疫菌全基因组测序的完成，体外克隆表达蛋白用以检测、诊断或用以制备疫苗已成为当今研究热点。长期以来，鼠疫菌的特异性抗原Fl，被用作鼠疫免疫学诊断的重要靶点。F1抗原是