中华鳖腐皮病的病原的分离鉴定和药敏试验

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1、中华鳖腐皮病的病原的分离鉴定和药敏试验　　中华鳖是浙江省四大水产养殖主导品种之一，据统计，2012年全省鳖养殖产量达到15.5万t。但随着中华鳖养殖的快速发展和集约化程度的不断提高，浙江省中华鳖发病日趋增多，给养殖业带来巨大的经济损失。腐皮病是中华鳖养殖过程中的主要病害之一，发病范围广，持续时间长，对浙江省中华鳖养殖产业造成了严重的损失。本文对浙江省中华鳖腐皮病的病原进行了初步分离鉴定和药敏试验。　　1材料与方法　　1．1材料和仪器　　病鳖取自浙江某养殖场，活力差，反应迟钝，四肢、颈部、背甲及裙边均有皮肤发生糜烂，解剖可见肝脏和胆囊肿大，肠道充血，肠腔无食物。　　健康鳖取自浙江萧山

2、某养殖场。　　VITEK32全自动细菌鉴定仪、GNI+卡和GNS506药敏试验卡购自法国生物梅里埃公司(bioMérieux);药敏纸片(直径6mm)购自杭州微生物试剂有限公司;培养基购自青岛海博生物技术有限公司。　　1．2病原菌分离　　取症状典型的病鳖，无菌条件下从病鳖肝、肾、脾等组织取样，划线接种于普通营养琼脂培养基上，28℃恒温培养24h后，挑取形态特征一致的优势菌落进行克隆培养，共分离到040908-1和040908-2两株细菌，转接斜面培养基保存备用。　　1．3人工感染试验　　试验采用60cm50cm40cm的塑料箱，每箱放养体重50～80g的健康中华鳖10

3、只，水温保持25℃左右，连续充气，暂养2d后进行感染试验。试验菌株培养18～24h后，以无菌生理盐水制成菌悬液，菌悬液含菌量按McF浊度管结合活菌计数方法确定，菌株040908-1为7.5108cfumL－1，菌株040908-2为8.2108cfumL－1。　　将2株菌的菌悬液作系列稀释(原液、10倍稀释液、100倍稀释液)后，以从右后肢注射(0.2mL只－1)的方法分别进行人工感染试验。对照组注射等量无菌生理盐水。感染组与对照组均设立两个平行组。　　1．4病原菌鉴定　　按照常见细菌系统鉴定手册［1］、伯杰细菌鉴定手册(第九版)［2］的方法进行细菌学鉴定，同时采用VITEK32全

4、自动细菌鉴定仪的GNI+卡进行比较鉴定。　　1．5药敏试验　　　　在普通营养琼脂培养基上以纸片法测定病原菌对不同药物的敏感性，经28℃恒温培养24h，观察抑菌圈的有无并用游标卡尺测量其直径，抑菌圈越大，则病原菌对该种药物越敏感［3］。同时采用VITEK32全自动细菌鉴定仪的药敏试验卡进行MIC测定。　　2结果　　2．1病原菌的分离　　病鳖的肝、脾、肾划线样品于28℃恒温培养24h后，所有营养琼脂表面均出现两种不同形态的优势菌:一种菌落圆形，直径约1.2mm，略隆起，光滑湿润，呈现一定的迁徙扩散生长现象，分离纯化后，编号为040908-1;另一种菌落直径1.8mm左右，圆形，边缘整齐

5、，表面湿润光滑，无迁徙扩散生长现象，分离纯化后，编号为040908-2。　　2．2人工感染试验结果　　健康鳖经菌株040908-1，040908-2人工感染，2d后陆续发病，发病率为100%;4d后病势加重并出现死亡，7d内死亡情况详见表1(两个平行组结果一致)。经2株菌人工感染的病鳖，四肢、颈部、背甲边缘等处皮肤均出现不同程度的溃烂，与自然发病鳖的症状基本一致。从感染死亡鳖分离细菌作鉴定，结果与试验菌株完全相同。将第二次分离菌株继续做人工感染，结果与第一次人工感染类似。试验期间对照组鳖健康活泼，无任何症状。由此证明菌株040908-1、040908-2均为中华鳖腐皮病的致病菌。【

6、1】　　　　2．3病原菌鉴定结果　　两株病原菌的生理生化鉴定结果如表2所示。菌株040908-1为杆状，革兰氏阴性，有鞭毛，具有运动性，氧化酶阴性，触酶阴性，生理生化反应与文献所述普通变形杆菌基本一致［1－2，4－5］。　　菌株040908-2杆状，革兰氏阴性，氧化酶阳性，生理生化反应与文献所述维罗纳气单胞菌基本一致［1－2，6－7］。　　根据全自动细菌鉴定仪VITEK-32的鉴定结果(表3)，菌株040908-1的生物编码为6012140120，属于普通变形杆菌(概率为99%)。菌株040908-2的生物编码为7000300064，属于维罗纳气单胞菌温和生物变种(概率为90%)。

7、结果与生理生化鉴定结果基本一致。　　综合上述结果，可以把菌株040908-1和040908-2分别鉴定为普通变形杆菌Proteusvul-garis和维罗纳气单胞菌温和生物变种Aeromonasveroniibiovarsobria。　　2．4药敏试验结果　　用纸片法测定了2株细菌对27种药物的敏感性(表4)。妥布霉素、新霉素、奥复星、先锋必素、庆大霉素、卡那霉素6种药物对2株细菌均有较强的抑制作用，氟哌酸、吡哌酸、链霉素、四环素对菌株040908-1有显着抑制作用但