dcsign特异性适配子的筛选及鉴定

《dcsign特异性适配子的筛选及鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、DCSIGN特异性适配子的筛选及鉴定：陈芳,曾洁,孙平,潘勤,章晓联【摘要】　　目的:筛选高特异性、高亲合力结合DCSIGN的单链DNA适配子,为开发抗HIV、HCV和结核杆菌感染的新型预防和治疗试剂奠定基础。方法:采用基于细胞表面展示的SELEX技术（TECSSELEX）,筛选出具有高亲合力结合DCSIGN的单链DNA（ssDNA）适配子;运用流式细胞术（FCM）检测该适配子的亲合力;对最高亲合力适配子库进行克隆和测序;ELISA和FCM方法检测单适配子ZD8与DCSIGN蛋白结合的剂量相关性;MTT

2、法测定IC50观察适配子对细胞的毒性。结果:第14轮筛选的适配子库亲和力最高;DCSIGN抗体能抑制适配子结合表达DCSIGN蛋白的细胞;第14轮库中筛选的单适配子ZD8与DCSIGN蛋白的结合率呈剂量依赖性;所筛选的单适配子对肝细胞几乎无毒性。结论:成功筛选出DCSIGN蛋白的ssDNA适配子,为防治HIV、HCV和结核杆菌感染等DCSIGN相关性疾病,提供新型预防和治疗的候选试剂和小分子药物。　　AIM:TodevelopthehighaffinityDNAaptamersployedtoscree

3、ntheDNAaptamersrecognizingDCSIGNdisplayedonthesurfaceofNIH3T3cells.SomeaptamersfromtheaptamerpoolsersandtargetcellseasuredbyfloetryandELISA.ThevaluesofIC50inedtodetectthetoxicityofaptamersforcellsbyMTTmethod.RESULTS:The14thaptamerpoolhadthehighestaffinityand

4、thebindingratesbeter(ZD8)andDCSIGNproteinanner.DCSIGNantibodycanpetitivelyinhibitthebindingreactionsbetersandtheirtargetcells.TheselectedaptamershaveveryloersboundtoDCSIGNproteiners）［2,3］。TECSSELEX技术是将细胞作为筛选介质的SELEX筛选方法,筛选中表面表达靶分子的细胞作为阳性正筛细胞,没有表达靶分子的同系细胞作

5、为阴性反筛细胞［4］。我们将表达DCSIGN蛋白的NIH3T3DCSIGN细胞作为阳性正筛细胞,运用SELEX技术对DCSIGN靶蛋白进行正向筛选,并用不表达DCSIGN蛋白的NIH3T3细胞进行反向筛选,最终获得能结合DCSIGN靶蛋白,同时可拮抗HIV、HCV病毒颗粒结合DCSIGN蛋白的生物活性小分子核苷酸适配子,以期开发预防和治疗感染性疾病的新型试剂。　　1材料和方法　　1.1材料细胞、细菌和质粒NIH3T3细胞（不表达DCSIGN蛋白的阴性反筛细胞）,NIH3T3DCSIGN细胞(表

6、达DCSIGN蛋白的阳性正筛细胞,本实验室转染并鉴定)。大肠杆菌DH5α,pUC19质粒为本实验室保存;DMEM培养基以及RPMI培养基购自Gibco公司;DNATaqpolymerase和dNTP购自TaKaRa公司;DNA纯化试剂盒购于OMEGE公司、T4DNA连接酶和DNAmarker为MBI公司产品;DCSIGN兔抗人多克隆IgG购自SantaCruzBiotechnology公司;HRP标记的羊抗兔IgG购自飞羿科技公司;FITC标记的引物和PE标记的羊抗兔IgG抗体购自Ebioscience公司;

7、HRPstreptavidin购自ptglab公司;GeneAmpPCRSystem2400PCR仪(FostercityCA94404,USA),DMLA(CEM培养液（含100mL/L胎牛血清,1×105U/L青霉素和0.1g/L链霉素）于37℃、50mL/LCO2孵箱中培养;HepG2细胞用RPMI1640培养液培养。　　1.2.2DCSIGNGST蛋白的提取、纯化和鉴定将含有pGEXKGDCSIGN的菌种BL21于含有氨苄青霉素(50mg/L)的LB培养基中37℃培养。培养到A600为1～2时

8、加入100mmol/LIPTG（终浓度为0.1mmol/L）,诱导融合蛋白DCSIGNGST的表达,30℃诱导5h。离心收集诱导后的菌体,将沉淀重悬于含1mmol/LPMSF的PBS中,于冰上超声碎菌后加入200mL/LTritonX100（终浓度10mL/L）,4℃,轻混1h。加入GlutathioneSepharose4B,室温轻混30min。将悬浊液收集于4