sirna设计研究进展及在线设计

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1、siRNA设计研究进展及在线设计：樊鹏程,贾正平,马骏,王荣【关键词】siRNA设计基因沉默RNA干涉序列分析　　研究基因功能的方法之一是减少或消除其在细胞中的表达。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术可以研究一个单独基因的作用,其效应因子为小干扰RNA(smallinterferingRNAs,siRNA)分子[1]。并非所有针对某基因不同位置碱基所设计的21个碱基siRNA都有相似基因沉默效率,针对同一mRNA内不同位置随机设计的siRNA表现明显不同活性[2]。siRNA沉默效率主要取决于21

2、个碱基序列的合理设计,如何设计针对目的基因的高效特异性siRNA是基因沉默的关键。使用生物信息学、计算机辅助手段选择最佳siRNA正成为研究的热点[3,4]。　　1siRNA设计规则研究　　借助生物信息学手段以选择最佳siRNA,可使用一些筛选模型优化寡核苷酸序列性质,诸如G/C比例,碱基变化以及序列中重复碱基数目。　　1.1siRNA反义链5′末端碱基设计RNA诱导沉默复合体(RNAinducedsilencingplex,RISC)形成的起始过程为一个解旋酶介导的siRNA末端解链过程。siRNA中一末端碱基配对越

3、松散,该末端越易被RISC解开。预测高效siRNA存在较松散的5′反义末端[5],可在siRNA反义链同RISC结合时引导其识别目的mRNA序列。若siRNA正义链5′末端为松散碱基配对,则可能导致非目的基因的沉默。　　1.2siRNA正义链设计为确定siRNA的特异性,Reynolds等系统地测定了针对萤火虫荧光素酶和人胞溶质蛋白B基因各197个碱基区域分别设计的各90个siRNA的沉默效率[2]。结果显示高效siRNA至少有超过3个A/U在15和19之间(正链末端的第1个碱基定义为位置1);A/U在19位,该规则反映

4、siRNA同自然发生的miRNA过程相类似;正义链位置3存在一个A,该结果支持miRNA同siRNA过程存在相似的蛋白机制的假说;A/U在10位,提示激活的RISC可能是在距离5′末端10到11个碱基位置针对mRNA发生作用。正义链19位不为G或C;正义链13位不为G。　　1.3G/C比例复含G/C的序列较富含A/T的序列更易形成稳定的双链,因此在一个序列中不应同时存在超过7个G/C配对,且同一序列中4个或更多的G因为易形成交连复合体而应被排除。测定dsRNA两末端的自由能及稳定性,结果表明依19个碱基设计的siRNA,

5、其G/C配对比例不宜超过36.8%[5]。　　1.4siRNA目的位置二级结构预测提高siRNA效率siRNA双链末端不同热力学稳定性,提示哪条链会进入RISC中。Heale等应用双链末端稳定性计算方法研究二级结构在siRNA设计中的作用,发现双链末端稳定性对于沉默效果预测影响占60%,二级结构预测可改善siRNA位点预测效率,80%的非作用位点可以通过二级结构预测来排除。　　1.5内部重复序列因包含内部重复序列或回文序列的siRNA可能形成潜在内部发卡结构或折叠结构,降低了siRNA有效浓度及沉默效力,故siRNA设计

6、时应避免内部重复序列。　　2通过非目的位点错配寻找高效siRNA　　优化siRNA序列来实现同非目的基因的最小错配,以最小化非目基因沉默。siRNA序列较短,按照同非目的位点最少存在3个以上的错配,一般有4至5个相邻的序列符合条件。故BLAST搜寻经常忽略了非目的候选物,而现有的准确搜寻方法执行时间太长。Yamada等[6]开发的高效siRNA算法,能准确快速地列出对于任意人类基因siRNA序列的潜在杂交位点,优于传统计算方法。　　3高活性siRNA筛选算法、模型研究　　3.1自组装图形技术Takasaki等[7]将自组

7、装图形技术和统计显著性差异分析用于筛选高活性siRNA序列,使用评分作为基因沉默效率的衡量。分析了针对12个基因中的172个siRNA序列,并同其他已报道的评分方法做了比较,结果其评分同基因沉默水平明显相关。　　3.2热力学及结构特征优化神经网络模型的建立建立可信的siRNA模型对于功能基因组研究十分必要,通过分析siRNA热力学参数及相关性分析,优化得到的神经网络模型能够有效预测不同浓度siRNA沉默效率[8]。该模型仅需较少siRNA序列参数即可预测siRNA沉默效率,减少了计算量。　　4siRNA在线设计　　Amh

8、ion,Dharmacon,Qiagen等公司网站及n.edu/siRecords/。　　5结语　　siRNA序列的设计优劣将直接影响RNAi效果,合理设计的siRNA序列能够提高基因沉默的效率。siRNA所含碱基序列、dsRNA双链末端的稳定性、目的mRNA上相应序列的二级结构及siRNA同RISC的结合均同RNA