大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定

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1、大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α-SM-actin)。结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管

2、平滑肌细胞。结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞　　[Abstract]ObjectiveToestablishtheculturemodelofrataortavascularsmoothmusclecells(VSMCs)toprovideimportantexperimentalmethodforthepathogenesisresearchofatherosclerosisinvitro.MethodsEmployingth

3、eexplantstechnique,theprimaryandsub-cultureodifiedtissue-pieceinoculationandtrypsindigestionrespectively.Theculturedcellsicroscopyandimmunohistochemicalandimmunofluorescentstaining.ResultsAfter3daysofinoculationoftissue-pieces,VSMCsmigratedfromthevesselpieces.Theculturedcellsshoorphologi

4、calfeaturesunderthemicroscope.Immunohistochemicalandimmunofluorescentstainingonoclonalantibodyagainstmouseα-SM-actindemonstratedthesecellspleandreliablemethodforobtaininghighlypurifiedandsatisfactoryVSMCsinshortterm,providingafavorableexperimentalplatformforresearchintothemechanismofvasc

5、ularproliferousdiseasessuchasatherosclerosisandrestenosis.　　[Keyethod;vascularsmoothmusclecells　　血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neointimaformation)及动脉粥样硬化(atherosclerosis)密切相关[1~4]。因此，研究防治VSMCs增殖与迁移成为血管生物学领

6、域研究的热点。本研究在参考国内外文献的基础上[5~8]，结合自己的经验，采用改良的植块贴壁法成功建立了大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型。　　1材料与方法　　1.1动物与试剂SPF级雄性SD大鼠1只，体重(150±10)g，中山大学实验动物中心提供，合格证号(粤监证字2006A064)。DMEM(Gibco)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(trypsin,Sigma)、T25塑料培养瓶(Costar)、特异性鼠平滑肌肌动蛋白抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)、FITC标记的羊抗鼠荧光二抗(SantaCruzBiochem)　

7、　1.2大鼠VSMCs的分离与原代培养SPF级雄性SD大鼠1只,重约150g，颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒2min，同时用酒精浇灌大鼠的胸腹部，移入超净台内。无菌条件下迅速取出全段胸主动脉,立即移入含冷PBS的无菌平皿中。使用1ml的一次性注射器拔去针尖后吸取PBS清洗去除血污，眼科镊去外膜结缔组织，此时将洁净血管转移到另一含冷PBS的无菌平皿中，用眼科剪小心剪去血管绒毛后用两弯镊反向牵拉去除外膜，再用眼科弯镊穿过血管沿两端来回牵拉一次，纵向剖开血管，使内膜面朝上,并用弯镊摊平血管，再将血管转移到含DMEM(10%胎牛血清)的无菌平皿