复方大果木姜子乳膏体外抗hsv1病毒的实验研究

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1、复方大果木姜子乳膏体外抗HSV1病毒的实验研究【摘要】目的通过对复方大果木姜子软膏Ⅰ号、Ⅱ号、Ⅲ号3个制剂处方水提、醇提物体外抗HSV1病毒作用的研究，优选出一个最佳组方提取工艺，为进一步将其开发成一种安全有效的治疗单纯性疱疹病毒的中药新药提供依据。方法通过细胞培养法，采用观察细胞病变(CPE)和噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性，观察复方大果木姜子软膏提取物抗HSVⅠ病毒感染的作用；以治疗指数（TI）为评价指标，比较各处方的抗病毒活性强弱。结果复方大果木姜子软膏Ⅰ号，Ⅱ号，Ⅲ号三个处方其水煎液及醇提液都有不同程度的体外抑制HSV1在Hep2细胞中增殖的作用；其中Ⅱ号处方的水提

2、取物作用最强。结论选用复方大果木姜子软膏Ⅱ号处方采用水煎提取作为制剂研究的最优处方工艺。【关键词】复方大果木姜子软膏；细胞培养实验方法；抗病毒活性；处方筛选大果木姜子CinnamomummigaoH.I1640培养（GIBCO公司）；胰酶（GIBCO公司）；新生牛血清（杭州四季青生物制剂公司）；平衡盐液：Hanks液；噻唑盐（MTT，北京天港邦定生物医学科技有限公司），其它试剂均为分析纯。MTT溶液：称取50mgMTT，放入小烧杯中，加入50ml维持液，过0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，分装于小试管中，放于－4℃冷藏室中保存，两周内有效。RPMI1640培养液：含10%新生牛血清的R

3、PMI1640培养液（含1×105u·L-1青霉素，100mg·L-1链霉素，0.2%heps）。维持液：成分同营养液，但小牛血清浓度为2%。临用前用5.5%碳酸氢钠液调pH值为7.4，4℃冰箱保存备用。消化液：胰蛋白酶液（0.25%胰蛋白酶加入0.01%EDTA，0.22μm的微孔滤器除菌）。使用前用5.5%NaHCO3调整pH值为7.6。　　1.2药物的制备以大果木姜子精油为主，分别配伍：珊瑚姜、杠板归、飞龙掌血、苦参、土荆皮、蛇床子、花椒等药物组成Ⅰ～Ⅲ号方。①号、③号、⑤号试验药物用70%的乙醇加热回流提取Ⅰ号，Ⅱ号，Ⅲ号3个处方，另加入超临界萃取的大果木姜子精油及0.5%吐温

4、80作为增溶剂，搅拌混匀，即得。②号，④号，⑥号试验药物用水煎煮提取Ⅰ号，Ⅱ号，Ⅲ号3个处方，另加入超临界萃取的大果木姜子精油及0.5%吐温80作为增溶剂，搅拌混匀，即得。以上药物用0.22μm的微孔滤器除菌。本实验中所列药物的浓度是按原生药浓度计算（大果木姜子精油按出油率为10%计算）。　　1.3仪器二氧化碳细胞培养箱(Thermoelectroncorporation)；超净工作台(苏州净化设备厂)；数字照相机：NikondigitalcamraTEF1200F；倒置显微镜：尼康TS100F；低速离心机：LD42(北京医用离心机厂)；通用酶标仪BIOTEXELX800uv

5、（美国产品）。　　1.4细胞细胞株：Hep2人喉癌细胞(细胞株由贵阳医学院免疫学教研室保存)。　　1.5病毒株病毒株：HSV1，由贵阳医学院基础医学院——组织培养及干细胞研究中心提供。在Hep－2细胞上复壮三代，传代增殖后，分装使用。　　2方法　　2.1病毒滴度的测定用含2%新生牛血清的RPMI－1640维持液将病毒稀释成10，102，103，104，105，106，107，108，109，1010倍10个浓度，按常量分别加入已长成单层细胞的96孔细胞培养板中，置于37℃，5%CO2温箱内孵育2h，弃去含病毒维持液，更换正常细胞培养液，继续培养，分别于1，2，3，4，5，6，7d在倒

6、置显微镜下观察记录细胞病变(CPE)程度。同时正常细胞对照。计算细胞半数感染量(TCID50)。　　2.2药物对细胞的毒性检测细胞用胰酶消化后，用培养液配成细胞密度为1×105/ml单细胞悬液，接种于平底型96孔培养板中（每孔加入0.2ml），适应生长24h，至细胞生长呈单层。①～⑥号药液分别用维持液进行二倍量系列稀释，把不同浓度的药液加入到培养板中（100μl/孔），每个剂量组设4孔细胞。用透明胶带封口后，置于培养箱中继续培养，同时设另设正常细胞。培养72h后，观察细胞病变(CPE)情况；并用噻唑蓝(MTT)比色法［5］检测细胞活性计算存活细胞的百分比。按Reed-Meuench法计算

7、各处方药物对细胞的半数毒性浓度(50%CytotoxityConcentration,CC50)。细胞存活率(%)=试验孔平均OD值对照孔平均OD值×100%药物对细胞生长的半数毒性浓度(CC50)CC50＝Antilog［B+（50-<50%抑制百分率/>50%抑制百分率-＜50%抑制百分率）×C］式中C=A-B；A=log(>50%药物浓度)；B=log(<50%药物浓度)　　2.3测定各处方对HSV－1