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《蜂胶佐剂对e.coli多价灭活苗免疫小鼠效果的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、蜂胶佐剂对E.coli多价灭活苗免疫小鼠效果的实验研究 免疫佐剂可增强抗原所激发的抗体应答,可提高免疫原性,以及增强吞噬细胞的非特异性杀伤功能和特异性细胞免疫的刺激作用等。因此,佐剂是疫苗特别是灭活疫苗所必不可少的成分。蜂胶作为一种具有生物活性的免疫佐剂所显示出的优点已逐渐被认识［1］。蜂胶具有广谱生物学活性,是一种良好的免疫增强剂和刺激剂［2］,它既能引起特异性免疫应答,又能启动非特异性防御机制,有增强免疫抗体生成和提高白细胞吞噬能力的明显效果［3］。 1材料和方法 1.1材料 致病性大肠杆菌O2、O78由华西医学院提供。O157菌株由本医学院实验室保存。改良
2、沙氏培养基、厌氧肉肝汤、三氯化铝、氢氧化钠、甲醛、9g/L氯化钠、蜂胶等购自大连宝生物工程有限公司。小白鼠(质量18～22g,60只,雌雄各半)由本医学院动物实验中心提供。 1.2方法 1.2.1小白鼠致死性试验 致病性大肠杆菌O2、O78及O157分别接种到伊红美蓝培养液上,37℃培养18～24h。取单菌落接种到5mL肉汤中,37℃、200r/min过夜。分别接种质量18～22g小白鼠5只,每只腹腔注射0.5mL菌液,并设注射同批无菌肉汤培养液的5只小白鼠作对照,隔离饲养,观察小白鼠发病和死亡情况。 1.2.2菌苗液培养及纯粹检验 将致病性大肠杆菌O2、O7
3、8及O157分别接种于牛肉汤内,37℃培养备用。将上述3种培养液等量混合,按1％的量接种肉汤的锥型瓶内,37℃培养24h,其间摇8次/2min,此时大肠杆菌含量最高,及时计数及灭活。取培养好的菌液,作检验,每瓶样品需用改良沙氏培养基,马丁肉汤琼脂斜面管2支,每支接种扩大培养液0.2mL;另用50mL的厌气肉肝汤和马丁肉汤各1瓶,分别接种扩大培养液0.5～1mL。37℃培养7d,观察细菌生长情况。 1.2.3活菌计数、甲醛灭活及无菌检验 取菌液1mL,按常规稀释法将菌液连续10倍稀释,取10-9、10-10两个稀释度用1mL无菌吸管取2个稀释度的菌液1mL,接种于普通
4、琼脂培养基中,37℃培养24h,次日数菌。按菌液总量的0.4％加入甲醛溶液（按含甲醛40％折算加入）,摇匀后,于37℃摇振培养杀菌2～4d。取灭活好的菌液,接种于营养琼脂培养基和血琼脂培养基上,同时接种厌气肉肝汤,37℃培养3～5d,观察有无细菌生长。若未见细菌生长则判为合格。检验合格后4℃保存,待配疫苗。 1.2.4佐剂和疫苗的制备 (1)氢氧化铝胶的制备:取25g无水AlCl3配成250mL/L溶液,使用时将其稀释成80mL/L。另将NaOH配成40mL/L溶液。将AlCl3溶液与Al(OH)3溶液混合高压灭菌,pH5.5。(2)蜂胶的制备:取蜂胶磨碎,溶解于9
5、50mL/L的分析纯乙醇中形成过饱和的蜂胶乙醇溶液作为制苗的佐剂,2h摇动1次,2min/次。(3)氢氧化铝胶佐剂灭活苗的制备按菌液5∶1的比例加入灭菌处理过的氢氧化铝胶和0.1g/L的硫柳汞,静置3～4d,4℃保存。(4)蜂胶佐剂灭活苗的制备:100mL灭活菌液中加入3mL蜂胶提纯液,充分摇匀后4℃保存。 1.2.5无菌、安全性及稳定性检验 取灭活好的菌液,37℃培养3d,观察有无细菌生长。取15只18～22g小白鼠,随机分成3组,一组为对照组,试验组分别接种2种疫苗,每只腹腔注射0.5mL,对照组腹腔注射0.5mL生理盐水。观察1周,记录临床症状和注射部位病变,
6、并于试验期末活检受试鼠,观察疫苗吸收状况。将疫苗置于4℃保存1个月,观察性状有无变化。 1.2.6小白鼠最小免疫剂量的测定 质量为18～22g的小白鼠50只分成2批,每批25只小白鼠,每批分为5组,每组5只,每批分别腹腔注射氢氧化铝胶灭活疫苗和蜂胶灭活疫苗0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL;同时设对照5只,注射生理盐水。10d后用E.coliO2、O78及O157混合菌液攻击,每只小鼠腹腔注射菌液0.5mL（5～8×1010CFU/L）,观察并记录小白鼠发病状况,测定其保护率(表1)。表1小白鼠最小免疫剂量的测定试验结果（略） 1.2.7效力检验 质量为
7、18～22g的小白鼠50只分成2批,每批25只小白鼠,每批分为5组,每组5只,每批分别腹腔注射蜂胶灭活疫苗和氢氧化铝胶灭活疫苗0.3mL和0.5mL,同时设对照5只,注射生理盐水接种后于第10天连同对照组用E.coliO2、O78及O157混合菌液攻击,每只小鼠腹腔注射菌液0.5mL（5～8×1010CFU/L）,观察1周,对发病与死亡小鼠剖检和检菌。求出疫苗的疫苗保护率=保护数/攻毒数×100%（表2）。 2结果 2.1菌种毒力鉴定及活菌计数 腹腔注射菌液的小白鼠在1d内全部死亡,解剖症状为急性败血性病变,说明所选用菌株为强毒株,
