金丝桃素对ｈｅｐｇ２ 细胞的体外杀伤效应的研究

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1、金丝桃素对ＨｅｐＧ２细胞的体外杀伤效应的研究作者：王晓利张俊松刘金钏杨汝德【摘要】　　目的研究金丝桃素及贯叶金丝桃中金丝桃素提取物对人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２的体外杀伤效应。方法通过测定胞内荧光强度以确定细胞对金丝桃素的吸收，用显微镜观察和ＭＴＴ法研究金丝桃素及其提取物对细胞的生长抑制作用。结果光活化的金丝桃素对ＨｅｐＧ２细胞有显著的体外杀伤效应，其抑制细胞生长的能力与金丝桃素的浓度、给药与光照的时间间隔以及光照能量密切相关。结论金丝桃素及其提取物能明显抑制ＨｅｐＧ２细胞的生长，预示金丝桃素及其提取物在癌症治疗中有良好的开发研究前景。【关键词】金丝

2、桃素光动力治疗肝癌发光二极管　　Abstract：ObjectiveＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅａｎｔｉｔｕｍｏｒｅｆｆｅｃｔｏｆＨｙｐｅｒｉｃｉｎａｎｄｅｘｔｒａｃｔｉｎHypericumperformatumＬ．ｏｎＨｅｐＧ２ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｏｆｈｕｍａｎｌｉｖｅｒｉｎｖｉｔｒｏ．MethodsTｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｕｐｔａｋｅｏｆＨｙｐｅｒｉｃｉｎperforatumＬ．中的一种生物活性物质，结构为萘骈二蒽酮类化合物，是一种良好的光敏剂。研究表明，其具有抗抑郁、抗ＨＩＶ及抗肿瘤等活性［１］。近年来，国外对金丝桃素在肿瘤的

3、光动力治疗（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃｔｈｅｒａｐｙ，ＰＤＴ）方面的研究开发十分活跃，但国内未见有关贯叶金丝桃中金丝桃素提取物在抗肿瘤方面的报道。本实验研究了金丝桃素和贯叶金丝桃中金丝桃素提取物对肝癌ＨｅｐＧ２细胞的生长抑制及诱导凋亡的作用。　　１材料　　人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２由国家生化工程技术开发中心提供；金丝桃素购于美国Ａｌｅｘｉｓ公司，下简称ＨＹ，分子质量５０４．４５；贯叶金丝桃的金丝桃素提取物，下简称ＨＹ提取物，由本实验室自制，经高效液相色谱分析金丝桃素的含量；ＲＰＭＩ－１６４０培养基为美国Ｇｉｂｃｏ公司产品；小牛血清购于杭州四季青生物工

4、程公司；胰酶－０．２５％ＥＤＴＡ为美国Ｇｉｂｃｏ公司产品；四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）购于北京鼎国生物技术有限责任公司；二甲亚砜（ＤＭＳＯ）为美国Ｓｉｇｍａ公司产品；其余试剂为分析纯。　　ＳｐｅｃｔｒａｍａｘＭ２型连续光谱光密度荧光检测仪（美国ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ公司），二氧化碳孵箱（德国Ｂｉｎｄｅｒ公司），倒置荧光显微镜（德国Ｌｅｉｃａ公司），光纤功率计（日本爱德万公司ＴＱ８２１０型），ＬＥＤ光源（定制于深圳佳进光电技术有限公司），微孔板（美国Ｃｏｒｎｉｎｇ公司）。　　２方法　　２．１细胞培养ＨｅｐＧ２细胞培养于含５％小牛血清、１０

5、０Ｕ／ｍｌ青霉素和１００μｇ／ｍｌ链霉素的ＲＰＭＩ－１６４０培养液中，３７℃，５％ＣＯ２及饱和湿度孵箱内单层贴壁生长。　　２．２细胞对金丝桃素的吸收实验对数生长期的细胞经消化制成细胞悬液，接种于９６孔细胞培养板上。培养至对数生长期后，吸去旧培养液，加入含ＨＹ的培养液，ＨＹ终浓度为１００ｎｍｏｌ／Ｌ，使各实验组细胞分别与ＨＹ共孵育０，０．５，１，２，４，６，８，２４ｈ，吸去培养液，ＰＢＳ漂洗２次，用ＳｐｅｃｔｒａｍａｘＭ２型检测仪在Ｅｘ＝４８５ｎｍ，Ｅｍ＝５９０ｎｍ条件下测细胞内荧光强度。　　２．３ＰＤＴ程序在生长状况良好的细胞中，加入不同浓度（

6、浓度以ＨＹ计，预实验表明所用浓度在非光照情况下对细胞无毒性）的ＨＹ提取物溶液或ＨＹ溶液，对照组不加ＨＹ溶液，加入相应体积的ＤＭＳＯ，其它处理方式与实验组相同。避光孵育一定时间后，将波长为５９０ｎｍ的黄色ＬＥＤ光源置于培养板正上方，用ＴＱ８２１０型光纤功率计测得光源功率密度约１．０５ｍＷ／ｃｍ２，分别照射３０，６０，９０ｍｉｎ，积累能量为３．７８，７．５４，１１．３Ｊ／ｃｍ２。ＰＤＴ后避光培养２４ｈ后，进行细胞形态观察，并用ＭＴＴ法测定细胞生长抑制情况。　　２．４ＭＴＴ法测定体外细胞毒作用将待检测的细胞弃去培养液，加入含ＭＴＴ０．５ｍｇ／ｍｌ的无

7、血清培养液１００μｌ，继续培养４ｈ后，吸出各孔液体，加入含０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ的异丙醇１００μｌ，振荡溶解１５ｍｉｎ，测定波长５７０ｎｍ下的各孔吸光值（OD５７０），计算细胞的生长抑制率［２］：　　生长抑制率（％）＝（１－实验组平均OD５７０值／对照组平均OD５７０值）×１００　　绘制ＨＹ浓度－生长抑制率曲线。　　２．５统计学分析用ＳＰＳＳ１０．０统计软件进行统计分析。　　３结果　　３．１细胞对金丝桃素的吸收曲线图１为细胞对ＨＹ的吸收曲线。显示了给药后不同时间细胞内的荧光强度，测定了相对荧光值（ＲｅｌａｔｉｖｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＵｎｉｔ

8、，ＲＦＵ），其反映了细胞摄入的ＨＹ量，可见胞内的ＨＹ含量在给药６ｈ后趋于饱和。　　图1HepG2细胞对HY的吸收曲线（略）　　３．２细胞的形态学变化正