肾综合征出血热患者软腭粘膜对乳鼠致病性的研究

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1、肾综合征出血热患者软腭粘膜对乳鼠致病性的研究　　【摘要】　目的　探讨肾综合征出血热(HFRS)的发病机理。方法　2～3天的近交系Balb/C乳鼠，脑内接种早期HFRS重症患者软腭粘膜出血点组织悬液，用套式聚合酶链式反应检测乳鼠脑、肺及肾组织中的HFRS病毒RNA。结果　接种乳鼠发病死亡，剖检显示，发病乳鼠各器官呈现明显微血管系统和实质组织病变，乳鼠脑、肺及肾组织中HFRS病毒RNA阳性。结论　早期HFRS患者软腭粘膜出血点组织中含有HFRS病毒。　　【Abstract】　Objective　Toexpiorethepathogenicmec

2、hanismofhemorrhagicfevere(HFRS).Methods　2-3daysoldinbredBalb/CsucklingmiceicebynestedPCR.Results　Someofthemicedevelopedacutediseaseanddied.Theautopsyanalysisindicatedthatthesemiceshomicrovascularandparenchymatoustissues.HFRSvirusRNAorrlngicspotsonsoftpalatepetechiaofHFRSpa

3、tients.　　【Keyouse　　Hemorrhagicfevere(HFRS)　　Softpalate　　Petechia　　Polymerasechainreaction　　肾综合征出血热(HFRS)是一种由肾综合征出血的热病毒(HFRSV)引起的以几种鼠类为宿主的严重传染病［1］。我们曾报道了一组经血清学证实的HFRS患者，在临床上软腭粘膜均有大小不等的出血点并以此作为临床早期诊断的指标［2，3］。应用电镜技术在数例患者软腭粘膜组织中找到了病毒颗粒，胶体金检测亦呈现阳性结果［4，5］。此发现首次证实了口腔软腭磷状上皮细胞属HFRS

4、V侵袭的靶细胞。1982年Tsai等报道经乳鼠脑内接种HFRSV可致其发病死亡，这种乳鼠模型沿用到今［6］。常规的乳鼠模型都是用HFRS病毒株使其致病，直接用出血热患者软腭粘膜组织制成悬液对乳鼠作脑内注射，目前尚未见报道。为了进一步探讨肾综合征出血热患者口腔软腭出血的发病机理及确证HFRSV的新定位，我们采取HFRS患者软腭出血点组织对乳鼠直接进行脑内接种，观察其对乳鼠的致病性。　　1　材料和方法　　1.1　组织取材　临床上确诊为HFRS的早期住院患者。临床分型：重型1例，中型2例(按1986年南京EHF学术会议标准)。患者的软腭均有独特的

5、出血点于出血点处常规消毒，持活检钳夹取大小约1mm×1mm×1mm粘膜组织数块，置于200目钢网上研磨。加入常规量青霉素，10%小牛血清，Eagle氏液(pH7.4)，混匀制成10%悬液，2000～3000r/min离心15～20min，取上清，液氮存放待检。取材局部粘膜用10%硝酸银烧灼止血，生理盐水涂洗2～3遍，观察片刻无出血倾向即可。　　1.2　实验动物及分组　2～3天体重为1.55～1.65g的Balb/C乳鼠50只(河南医科大学动物实验中心提供)。分为5组，每组10只，第1组乳鼠脑内注射0.02ml生理盐水；第2组乳鼠脑内接种0.

6、02ml重型HFRS患者软腭粘膜组织悬液；第3、4组乳鼠脑内接种0.02ml中型HFRS患者软腭粘膜组织悬液；第5组乳鼠脑内直接注射0.02mlA16株HFRS病毒悬液；实验组及对照组乳鼠均由母鼠喂养，逐日观察发病情况。　　1.3　RNA的提取　实验组及对照组乳鼠的脑、肺及肾组织各30mg，PBS缓冲液冲洗后加入1mlGIT缓冲液进行匀浆。用蛋白酶K-SDS液消化(蛋白酶K，100μg/ml;SDS,0.5%)37℃温育30分钟。采用酚-氯仿法提取RNA［7］。　　1.4　套式聚合酶链式反应(Nested-PCR)　Nested-PCR试剂

7、盒购于第四军医大学基因诊断技术应用研究所。第1对引物：(1)5′-GAGATGATCATCAGGTTCAA-3′，(2)5′-GTGATAACATGGATCCTGAG-3′；第2对引物：(1)5′-TTGCTGATGTGATGGCAGTCTCT-3′，(2)5′-AAGCTTTAGTAGTAGACTCC-3′。利用该引物对可特异性地扩增出位于HFRSV高度保守区序列的430bp的基因条带。第1次扩增：反应体系为50μl,其中含有20mmol/LRNA抽提液，0.5μmol/L第1对引物，40U的RNase,5.6U鸟成骨髓瘤病毒逆转录酶，1

8、0mmol/LTris-HCl(pH8.3),1.5mmol/LMgCl2,0.01%明胶，200μmol/LdNTP;反应程序：94℃热启动60s，随后94℃变性35s，55℃