异种脱蛋白骨复合物修复大段骨缺损的血管化观察

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1、异种脱蛋白骨复合物修复大段骨缺损的血管化观察作者：简月奎，李起鸿，刘雷，杨柳【摘要】［目的］探讨异种脱蛋白骨(heterogeneousdeprotEinbone，HDPB)复合物修复胫骨大段骨缺损过程中的血管化实验研究，为异种脱蛋白骨的临床应用提供实验依据。［方法］山羊24只，在右侧胫骨中下段截除胫骨总长度20％形成节段性骨缺损，实验组18只，植入异种DPB+自体MSCs+rhBMP2，用半环槽式外固定器固定。于术后每隔4周对3只进行股动脉墨汁灌注后处死，取新骨组织制成厚切片观察血管化情况，以另6只植入自

2、体骨为对照。［结果］术后4～24周，实验组与对照组血管表现数目逐渐增多，排列渐趋规则，血管大小、分布区域趋向均匀。测量血管数目和面积，结果显示4～24周2组血管数目和面积统计学分析差异无显著性意义(P>0.05)。［结论］异种脱蛋白骨复合物修复大动物大块骨缺损过程中血管化程度与自体骨相当，可以作为组织工程支架材料，并对其免疫原性和成骨能力等性能进行进一步研究。【关键词】异种脱蛋白骨；骨缺损；血管化；骨组织工程　　创伤、感染和肿瘤等造成的大块骨缺损修复是骨科的难题。自体骨、同种异体骨、异种骨作为骨移植材

3、料均有一定的局限性。组织工程技术的兴起为骨缺损修复带来新的希望，支架材料是骨组织工程研究的重要内容，制备来源丰富、价格低廉、性能优良的支架材料是研究热点之一。近年来虽有异种骨作为骨移植的替代材料的许多研究，如KEIl骨、BioOss骨等［1］，但没有完全解决异种骨的免疫原性及生物力学性能等问题。植入后移植物血管化较慢，而血管化快慢是关系移植物成活及成骨能力大小的重要因素，如成骨能力差，只能修复小段骨缺损或小动物骨缺损。异种骨修复大动物大段骨缺损过程中血管化研究报道较少。本实验以本科研制的改良法［2］制备异

4、种脱蛋白骨作为组织工程支架材料修复大动物长骨大段缺损，并与自体骨移植作比较，观察其成骨过程中血管化，结果令人满意，现报道如下。　　1材料与方法　　　　1.1主要仪器和试剂　　市售猪股骨;市售墨汁；20%甘露醇(西南药业公司)；10％甲醛、浓盐酸、三氯化铁(重庆化学试剂厂)；半环槽式外固定器(第三军医大学李起鸿教授研制)；超低温冰箱(NUAIR，USA)；速眠新(军事医学科学院军事兽医研究所)；肝素钠(天津生化制剂厂)；氯胺酮(江苏恒瑞医药股份有限公司)。　　　　1.2异种DPB的制备　　参照改良法［2］制备

5、，将制备的猪DPB放入-80℃超低温冰箱冷冻3个月后取出，在-700mmHg真空下包装，60Co照射后置-4℃保存。DPB于术前浸入含rhBMP2浓度为75ng／ml［3］溶液中2h备用。　　1.3实验动物分组　　　　山羊(第三军医大学动物实验中心提供)，10～12个月龄，雌雄不限，分笼喂养，体重(22.5±2.5)kg。随机均分2组，按植入材料分为实验组(异种DPB+自体MSCs+rhBMP2)和对照组(自体骨)。　　1.4山羊MSCs培养及与异种DPB复合　　　　分离培养、收集山羊MSCs，调整细胞浓度

6、为1.0×106／ml，将细胞悬液接种于异种DPB／rhBMP2上，2ml／块，放入37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养6h再加含15％FBS的DMEM／F12培养基1ml，2～3d后常规换液。　　1.5动物手术　　术前拍双侧胫骨X线片，测量胫骨干长度，所有动物骨缺损制备和外固定相同，操作由同一组人员完成。半环槽式外固定器固定，所有螺母旋紧。根据X线片得到的胫骨长度，右侧胫骨中下段造成20％骨和骨膜段缺损［4］，据分组植入不同的植入物，其中MSCs均来自山羊自体骨髓。术后每隔4周摄肢体正侧位X线

7、片。肌注速眠新0.08ml/kg，麻醉后固定，常规条件摄片。　　1.6配制墨汁及灌注　　市售墨汁过滤后，按7∶2∶1的比例将墨汁、10％甲醛和20％甘露醇混合配制成灌注液，6层医用纱布过滤，用前恒温水浴加热至38℃。速眠新0.08ml／kg与氯胺酮2mg/kg肌肉注射复合麻醉后固定，肝素1000U／kg肌注全身肝素化，在腹股沟区切开皮肤、皮下组织，游离股、静脉。结扎股动脉、离断，远端插管、固定；结扎股静脉、离断，远端切开放血。快速向股动脉远端推注大量肝素生理盐水(每500L生理盐水中加入肝素12500U)冲

8、洗直至股静脉流出清亮液体为止。然后从股动脉注入38℃墨汁灌注液至股静脉流出黑色液体，皮肤趾甲变黑，结扎股动、静脉。处死山羊，取下胫骨，低温放置24h后10％甲醛溶液中固定2周。进行大体解剖及厚切片观察新骨血管化情况。　　1.7大体解剖观察　　切开皮肤，暴露皮下组织和肌肉及剔除肌肉暴露骨膜，观察皮下组织、肌肉和骨膜血管网。　　1.8墨汁灌注厚切片血管计数和血管面积图像分析观察　　取不同时间点新骨2％EDTA脱钙，以