抗人卵巢癌单链抗体噬菌体表面呈现文库的构建、初步筛选及鉴定

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1、抗人卵巢癌单链抗体噬菌体表面呈现文库的构建、初步筛选及鉴定：杜辉，王建，辛晓燕，郑维国【关键词】卵巢肿瘤　　【Abstract】AIM:ToconstructthephagedisplaylibraryofantihumanovariancancersinglechainFvantibody.METHODS:TheScFvgenelibrary94individualphagemidclones.CONCLUSION:Intheproductionofengineeringantibodiesagainsthumancancer,t

2、hisstrategymayprovideanalternativeapproach.　　【Keys　　【摘要】目的：构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库.方法：利用噬菌体表面呈现技术，构建基因文库，经过panning筛选富集后，用ELISA方法检验抗原结合活性.结果：从单个噬菌体克隆中筛选到26个具有抗原结合活性的阳性克隆.结论：噬菌体表面呈现技术为构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现文库提供了一条更为有效的新途径.　　【关键词】噬菌体表面呈现；单链抗体；卵巢肿瘤　　0引言　　噬菌体表面呈现技术［1］是构建基因

3、工程抗体的重大突破.利用噬菌体表面呈现技术构建的表达性基因文库称为噬菌体呈现文库［2］（Phagedisplaylibrary），该文库利用其呈现的多肽可与特定配基亲和结合的性质而高效率地筛选目的基因，用于抗体基因文库和随机多肽基因文库的构建和筛选.单链抗体［35］（SvFc）是用基因工程方法将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段连接肽（Linker）连接而成的重组蛋白，是保持了亲本抗体抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段.与完整IgG几Fab段相比，具有免疫原性低、血液清除快、肿瘤穿透力强等优点，因此是将药物、毒

4、素、放射性毒素导向肿瘤的很有价值的分子，在肿瘤导向治疗和诊断试剂的发展上具有巨大的潜力.本实验就是利用噬菌体表面呈现技术，构建了抗人卵巢癌单连抗体基因噬菌体表面呈现文库，并从中筛选到了有抗原结合活性的抗体.　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1实验动物BALB/c小鼠，雌性，6acia公司.　　1.1.3主要试剂福氏完全佐剂购自Sigma公司；Trizal试剂购自Gibco公司；反转录系统购自Promega公司；PCR引物和HRP/羊抗M13噬菌体抗体、T4DNA连接酶、限制性内切酶购自Pharmacia公司；TaqDNA聚合

5、酶购自Takara公司.　　1.1.4试剂配置①SOBAG琼脂板蛋白胨20g，酵母提取物5g，氯化钠0.5g，琼脂15g，加水至900mL，高压灭菌后冷却至50℃-60℃，加入无菌的1mol・L-1氯化镁溶液10mL，2mol・L-1葡萄糖55.6mL，20g・L1氨苄青霉素5mL，立即铺板.②2×YTAG2×YT培养液中含100mg・L1氨苄青霉素和20g・L1葡萄糖.③2×YTAK2×YT培养液中含100mg・L1氨苄青霉素和50mgӥ

6、9;L1卡那霉素.④封闭液含100g・L1牛奶的1×PBS.　　1.2方法　　1.2.1抗原制备取新鲜卵巢癌手术切除标本（取自西京医院妇产科，病理诊断为卵巢浆液性囊腺癌），按照高渗盐法［6］制备卵巢癌细胞抗原，饱和硫酸铵沉淀后，0.01mol・L-1PBS透析，冷冻干燥，－20℃保存备用.　　1.2.2动物致敏初次免疫，以抗原加福氏完全佐剂行皮下多点注射；第2，3次免疫，抗原腹腔注射；第7周，ELISA法检验抗体滴度，测滴度为1106，进行第4次免疫，以抗原加福氏完全佐剂行皮下多点注射；第8周，抗原腹腔注

7、射，连续免疫3d.　　1.2.3从总RNA中纯化mRNA及反转录取致敏小鼠脾脏，按每100mg组织加Trizal1mL比例加入Trizal，充分匀浆，提取总RNA.参照Promega说明书纯化mRNA.采用Pharmacia公司的MouseScFvModule/RebinantPhageAntibodySystem提供的反转录试剂合成CDNA第一链.　　1.2.4VH，VL基因的扩增和鉴定分别以10种VH和VL混合物为引物，以cDNA第一链为模板，PCR扩增全套VH,VL基因，反应体积50μL，反应条件为：94℃1min，55℃2m

8、in，72℃2min.共30个循环.循环结束后，从各反应体系中取5μL进行琼脂糖凝胶电泳.胶回收并纯化VH，VL基因,用Pharmacia公司的MouseScFvModule中提供的VHmarker定量.　　1.2.5VH，VL基因的