结缔组织生长因子单克隆抗体超微超顺磁氧化铁粒子的制备及其生物活性的研究

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1、结缔组织生长因子单克隆抗体超微超顺磁氧化铁粒子的制备及其生物活性的研究：吴媛，吴国球，刘乃　,张松，张宇【摘要】目的：通过化学合成方法制作结缔组织生长因子(connectivetissuegroallsuperparamagicironoxide,USPIO)粒子分子探针，并检测其生物活性。方法：采用EDC(1ethyl3[3dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride)化学连接剂将CTGF单克隆抗体与DMSA[meso2,3dimercaptosuccinicacid(HOOCCH(SH)CH(

2、SH)COOH)]修饰的USPIO相结合，形成具有免疫活性的分子探针。通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及arker(美国BioRad公司)，酶标仪(美国Sigma公司)。　　1.2方法　　1.2.1CTGF单克隆抗体超顺磁粒子的制备采用东南大学生物科学与医学工程系合成DMSA修饰的USPIO，直径为10～15nm，质量浓度7.8g·L-1。将其用去离子水冲洗3次，重悬于1ml的PBS溶液中(0.1mol·L-1，pH5.6)，稀释至终质量浓度0.1mg·ml-1，并经超声分散20min。将新鲜配制的EDC溶液(10mg·ml-1)加入USPIO的

3、溶液中，在室温下轻晃5min后再分别加入25、50、100、200μg的单克隆抗体，将上述溶液混匀，于室温下轻晃反应2h。结合上单抗的USPIO用永磁铁从溶液中分离，并用PBS(0.1mol·L-1,pH7.0)冲洗3次。将结合单抗及同质量未结合单抗的USPIO，加入含有1%BSA的PBS(0.1mol·L-1,pH7.0)溶液1ml。37℃孵育2h后弃去溶液，再用PBS(0.1mol·L-1,pH7.0)冲洗3次。最后重新悬浮于1mlPBS(0.1mol·L-1,pH7.0)溶液中。　　1.2.2ELISA试验取一定量CTGF抗原，用pH7.20.1mo

4、l·L-1的PBS稀释至适当浓度，包被96孔酶标板，100μl·孔-1，4℃过夜。清洗3次后加入1%BSA的封闭液，200μl·孔-1，37℃孵育2h。清洗5次后分别加入结合上述不同浓度的单克隆抗体及未结合单抗的USPIO，50μl·孔-1，37℃孵育1h，清洗5次后加入一定稀释度的HRP标记的单抗，50μl·孔-1，37℃孵育1h。清洗5次后加TMB显色液A、B各50μl·孔-1，37℃孵育15min,加入终止液50μl·孔-1，测得各孔A450nm/A630nm。　　1.2.3arker加入到样品孔中，通过SDSPAGE凝胶分离，然后转印至PVDF膜

5、上,之后用PBST溶液(1‰Tol·L-1,pH7.4)漂洗，室温下用含有5%脱脂奶粉封闭2h。分别将结合单克隆抗体100μg的USPIO及未结合单抗的USPIO稀释10倍后与PVDF膜一起孵育，4℃过夜。PBST漂洗3次，置于摇床室温，每次10min。加入用PBST稀释的二抗，与膜共孵育，置于摇床室温2h。用PBST漂洗3次，置于摇床室温，每次10min。滤纸吸干膜上的水分，将膜移至干燥的保鲜膜上，ECL液均匀滴加在PVDF膜上，用保鲜膜包住PVDF膜，放在夹板上，剪一张稍大于PVDF膜的胶片覆盖于膜，夹紧夹板，曝光后分别置于显影液、定影液中显影，即可观

6、察条带。　　1.3统计学处理　　用SPSS15.0统计软件分析数据。计量资料以x-±s表示，统计分析采用oneg)反应后，所得生成物于波长450nm/630nm处测得各浓度吸光度值分别为0.517±0.128、0.891±0.194、1.185±0.122、1.633±0.048。经统计学分析，PBST组与单纯USPIO对照组相比无显著差异(0.057±0.013vs0.088±0.020，P>0.05);单纯USPIO对照组与不同质量各组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。不同质量单克隆抗体(25、50、100、200μg)与USPIO

7、(0.1mg)反应后生成物，于PBS(0.1mol·L-1,pH7.0)溶液中4℃保存30d及60d后，再次洗涤3次并重悬浮于1mlPBS(0.1mol·L-1,pH7.0)溶液中，于波长450nm/630nm处测得各浓度吸光度值，并求其平均值(n=3)，结果如图1。200μg组0、30、60d间吸光度值比较明显降低，差异显著(P<0.05)，其余各组0、30、60d间吸光度值比较无显著差异(P>0.05)。　　2.2arker大约相对分子质量30000处显示条带，且单纯100μg单克隆抗体组条带比较深，而未标记单克隆的USPIO组未见显影条带

8、。　　抗体蛋白质通过两种吸附方式连接到磁纳米粒子表面，一种是以形成