纳米肿瘤疫苗的制备工艺的优化及特性鉴定

《纳米肿瘤疫苗的制备工艺的优化及特性鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、纳米肿瘤疫苗的制备工艺的优化及特性鉴定【关键词】肿瘤特异性抗原脂质体树突状细胞肿瘤疫苗　　肿瘤疫苗能诱导特异性的抗肿瘤免疫反应,在肿瘤防治上已经显示出一定的效果,被认为是最具前景的肿瘤治疗方法。本实验室运用MAGE3/Hsp70的融合蛋白免疫小鼠,结果显示融合蛋白诱导机体产生高效的MAGE3特异性CTL,对表达MAGE3的B16细胞有很好的杀伤效果［1］。为了使该融合蛋白能更好地被机体摄取且更好地靶向肿瘤组织,更有效地激活机体产生针对MAGE3的特异性CTL,对表达MAGE3的肿瘤细胞具有更强的杀伤作用,本部分实验中采用纳米脂质体为载体,包裹MAGE3/Hsp70的融合蛋白（M

2、H）制备恶性肿瘤基因工程纳米疫苗。　　1材料和方法　　1.1材料　　分光光度计（UV3000型）为日本岛津公司产品;透射电子显微镜（JEM2000EX型）为日立公司产品;集热式恒温加热磁力搅拌器（DF101B型）为巩义市予华仪器有限责任公司产品;20kHz/500er公司产品;RPMIl640培养基购自美国Gibco公司;蛋黄卵磷脂和胆固醇为德国Merck公司产品;其他试剂均为进口超纯级或国产分析纯级;pET28α（+）MAGE3/Hsp70质粒由本实验室研制。　　1.2方法　　1.2.1MAGE3/Hsp70融合蛋白的纯化与鉴定　　MAGE3/Hsp70融合蛋白的纯化

3、见文献［1］。采用AGE3/Hsp70融合蛋白进行鉴定,即取10μgMAGE3/Hsp70的融合蛋白,采用20μL20mol/LPBS重悬细胞,加入20μL2×LoadingBuffer,进行SDSPAGE。采用80V,60min转移PVDF膜,50g/L脱脂乳TTBS室温下封闭PVDF膜60min,用TTBS1∶500稀释MAGE3抗血清,从封闭液中取出膜,放入抗血清中,37℃60min。TTBS洗膜3次每次10min,采用TTBS缓冲液1∶5000稀释HRP标记的生物素化二抗,37℃60min,TTBS洗膜,DAB显色。　　1.2.2纳米脂质体的制备及工艺优化　　采用薄膜

4、分散超声法制备纳米疫苗,选用4因素、3水平正交设计进行工艺优化见表1（4个因素分别为大豆卵磷脂和胆固醇摩尔比（A）、脂和水体积比（B）、超声时间（C）、PBS的pH值（D）,以包封率为考察指标来筛选处方）。脂质体具体制备步骤如下：秤取处方量的大豆卵磷脂和胆固醇于100mL烧瓶中,加入氯仿1～2mL,置于65～70℃水浴中,于旋转蒸发仪上旋转,减压除去氯仿,得到磷脂膜。另取溶有目的蛋白（1g/L）的PBS（pH=7.5±0.5）20mL于小烧杯中,同置于65～70℃水浴中,保温待用。取预热的PBS,加至含有磷脂膜的烧瓶中,65～70℃水浴中搅拌水化10～20min,即成脂质体液

5、。取出该液于烧杯中,置于磁力搅拌器上,室温下搅拌30～60min。冰水浴条件下超声10～20min,即得脂质体胶体液。0.1μm聚碳酸树脂纤维过滤3次,整粒,得粒径较均匀的脂质体。用0.22μm的滤膜过滤除菌后,于4℃保存。表1各个因素不同配比的正交设计（略）　　1.2.3NL（MH）的性质鉴定　　(1)形态观察:将制成的NL（MH）500倍稀释于生理盐水中,取100μL滴于400目铜网上,1min后吸去上清,10g/L磷钨酸负染色1min,自然晾干后在透射电子显微镜下观察其形态。将采集的图象经计算机图象分析,求得NL（MH）的平均粒径。(2)包裹率及稳定性测定:采用Sephe

6、dexG100凝胶层析法,洗脱液为PBS,流速为0.5mL/min。取NL（MH）1.0mL上柱,收集游离峰即为游离的MH。同时制备不同浓度的MH标准蛋白样品,Bradford法测定蛋白的含量,计算出NL（MH）中游离MH的含量。将制备的NL（MH）置于4℃冰箱保存6个月后或3000r/min10min离心后,电镜观察纳米脂质体形态,明确其稳定性。包封率=（系统中的总药量液体介质中未包封的药量）/系统中的总药量×100%。(3)纳米疫苗急性毒性:实验取二级条件C57BL/6小鼠20只,雌雄不拘,随机分为2组,每组10只。PBS对照组：腹腔注射PBS1.0mL/鼠;纳米疫苗（

7、NL（MH）组）:腹腔注射包封MH的最大浓度0.3g/L的纳米疫苗,1.0mL/鼠,观察实验鼠有无急性中毒表现,并记录两周内死亡小鼠的只数。实验结束时处死动物、剖检（肉眼观察主要脏器的大小、硬度、有无胸腹腔积液等）、取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏,用4g/L的甲醛固定,石蜡包埋,HE染色,行病理组织学观察。　　1.2.4统计学处理　　应用SPSS11.5统计软件进行数据分析,P<0.05表示有统计学意义,计量数据结果均以x±s表示。组间差异性比较采用oneAGE3/Hsp70融合蛋白