宁夏地区绵羊博尔纳病病毒自然感染状况研究

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1、宁夏地区绵羊博尔纳病病毒自然感染状况研究：刘建，马彦，王振海，谢鹏【摘要】目的探讨中国宁夏地区绵羊博尔纳病病毒(Bornadiseasevirus，BDV)的自然感染状况，并分析比较中国宁夏地区绵羊自然感染BDVp24基因序列与国外人和动物BDV分离株及其标准株StrainV和He/80的同源性。方法采用巢式逆转录荧光定量PCR(FQ-nRT-PCR技术)检测了中国宁夏地区268例绵羊PBMCs中BDVp24基因片段，对阳性标本FQ-PCR产物进行基因序列测定，测序结果应用BLAST软件以及DNAsist5.0软件对测序结果分析，与国外人与动物的BDV分离株以及标准株Strain

2、V和He/80进行序列比较。结果268例中4例绵羊外周血BDVp24基因片段阳性，阳性率为1.49%;测序分析结果表明，宁夏地区绵羊感染的BDVp24的核苷酸序列与马源性病毒株H3575同源性最近，同源性为98.84%(85/86)，与标准株StrainV和He/80同源性为94.19%和100%。并且它们编码的氨基酸序列相同。结论宁夏地区绵羊中可能存在动物源性的BDV自然感染，该地区感染的BDVp24核苷酸序列与马源性病毒株H3575、标准株StrainV和He/80存在高度的同源性，其感染可能相同亦或存在相互之间感染的可能【关键词】Borna病病毒;感染;巢式逆转录荧光定量P

3、CR博尔纳病病毒(Bornadiseasevirus，BDV)是一种非分节段的单股负链嗜神经的RNA病毒，是引起人和动物共患病博尔纳病(BornaDisease，BD)的病原体[2]，感染后主要侵犯中枢神经系统导致严重后果，有可能引起动物之间的传染而引起大规模动物死亡。迄今为止，中国虽未见大规模的BDV流行报道，但有报道在新疆、重庆、宁夏以及台湾地区的马、牛、人等存在散在BDV自然感染。本研究应用FQ-nRT-PCR技术检测宁夏地区268例绵羊外周血单个核细胞(PBMCs)中BDVp24基因片段，对阳性标本FQ-PCR产物进行克隆和测序分析，以探讨中国宁夏地区绵羊BDV自然感染状

4、况，进而比较分析中国绵羊自然感染的BDV与国外人和动物BDV分离株及其标准株StrainV和He/80在种系发生中的关系。　　1材料和方法　　1.1研究对象268例绵羊均来自宁夏地区，每例采外周血5mL，EDTA抗凝。　　1.2主要试剂及仪器主要试剂：淋巴细胞分离液(Ficoll-conray液)，TrizolRNA提取液(购自BioFlux)，Borna病病毒荧光定量PCR诊断试剂盒(广州达晖生物技术有限公司)，PE7700FQ-PCR(美国ABI公司)。　　主要实验仪器：752紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)，Bio-RadPCR仪(日本)，Heraeus低温高速离心

5、机(德国)，Rotor-Gene6000荧光PCR仪(澳大利亚)，SANYOULTRALOCs，再按照RNAisoTMPlusRNA提取试剂提取总RNA。提取的RNA保存在-80℃冰箱。2)对RNA样本进行纯度检测、浓度计算和完整性检测：将上述保存于-70℃冰箱中的绵羊PBMCsRNA样本随机取出4例，4℃8000r·min-1离心5min，弃上清液;再用75%乙醇重复洗涤，4℃8000·min-1离心5min，吸干残余液，RNA沉淀置室温干燥15min去除残留乙醇;加入无RNase水50μL，55℃水浴10～15min溶解RNA;取5μL提取的RNA稀释100倍，用紫外分光光度

6、计测OD260、OD280及二者比值，计算RNA浓度，公式为：OD260×核酸稀释倍数×40/1000，单位μg·μL-1。其余RNA置-70℃冰箱中备用。采用1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭浓度为0.5μg·μL-1)电泳。取RNA样品10μL上样，以3～4V·cm-1的电压电泳25min，在凝胶成像分析仪中观察结果并照相。3)FQ-nRT-PCR检测BDVp24基因片段阳性定量标准曲线的建立：将鉴定好的质粒(重庆医科大学提供)测定OD值，计算拷贝数，按107、106、105、104、103拷贝数·μL-1浓度梯度稀释，加5μL于不同反应管中，在PE7700FQ-PCR上进行扩增。同

7、时每8s检测1次PCR产物的量(即反应管中荧光值Rn的变化)。其原理是在常规PCR基础上，在反应体系中加入了一种带有2个荧光基团标记的特异性寡核苷酸探针进行FQ-PCR。所有反应信息资料被Opticon-2FQ-PCR扩增仪收集并储存于其附件Macintosh电脑分析软件中，反应结束后该电脑根据阳性定量标准模板的扩增情况自动绘制出标准曲线。　　1.3.2FQ-nRT-PCR按Borna病病毒荧光定量PCR诊断试剂盒说明进行。首先进行逆转录反应，在含样本RNA的反应管中加入下列逆转