病原菌的分离、纯化和保存

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1、实验十七、病原菌的分离培养、纯化和保存一、目的要求　　(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。　　(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。　　二、基本原理　　植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。　　植物病原

2、真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。　　为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。　　三、材料、仪器与用具　　1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考)　　(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyriculariaorycae)。　　(2)玉米大斑病叶(Exserohilumturcicum)。　　(3)玉米弯孢菌叶斑

3、病叶(Curvularialunata)。　　(4)玉米小斑病叶(Bipolarismaydis)。　　(5)番茄灰霉病果(BotrytiscineFca)。　　(6)黄瓜菌核病果(Sclerotiniasclerotiorum)。　　(7)黄瓜细菌性角斑病叶(Pseudomonassyringaepv．1achrymans)。　　(8)水稻白叶枯病叶(Xanthomonascampestmspv.oryeue)。　　(9)大豆细菌性斑点病叶(Pseudomonassyringaepv．glycinea)。　　(10)白菜软腐病叶(Erud

4、niacarotovorasubsp．carotovora)。　　2．培养基PDA培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。　　3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0．1％升汞溶液配制：升汞1e浓盐酸2．5ml蒸馏水1000ml。先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心。　　四、实验操作　　(一)病原真菌的分离　　1．组织分离法按照以下

5、步骤进行：　　(1)取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。　　(2)用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60C左右的PDA培养基倒人培养皿中，每皿倒10--15ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示：

6、加入25％乳酸1～2滴，可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／ml)可以抑制G+细菌生长；加多黏霉素B(5．0μg／ml)可以抑制G—细菌生长；加链霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／ml)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45C左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)’时加入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火焰上方，一般很少污染。　　(3)取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料

7、)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块(海边长3--4mm)病组织数块。提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。　　(4)将病组织放人70％酒精中浸3—5s后，按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5rain(也可使用其他表面消毒剂)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。提示：先用70％的酒精浸2、

8、3s是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至lmin)。升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下