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1、李春勇(中国科学院亚热带农业生态研究所湖南长沙410125)摘要:数字PCR(dPCR)是近年来引起重视并迅速发展起来的一种突破性的核酸定量分析技术。该技术先将核酸模板进行稀释,分配到大量独立的反应单元中,使每个反应单元中只有单个模板分子,然后进行PCR扩增反应,扩增结束后对每个反应室的荧光信号进行统计学分析,来定量DNA拷贝数。数字PCR采用先扩增后定量,因此不依赖扩增曲线的循环阈值(Ct),也无需采用内参基因和标准曲线,准确度高、重现性好,可以实现绝对定量分析。由于其独特的技术优势,已经在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达分析、环境微生物检测和下一代测序等
2、研究领域显示出巨大的优势和应用前景。本文对数字PCR技术原理、定量分析方法、系统分类和应用等进行概述。关键词:数字PCR有限稀释泊松分布中图分类号:R450文献标识码:A文章编号:1674-2060(2014)11-0010-04数字PCR(digitalPCR,dPCR)是近年来引起重视并迅速发展起来的一种突破性的定量分析技术。1992年Sykes等[1]检测复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因时,利用样品的有限稀释,让每个孔中只获得单个模板分子,通过计算PCR后的扩增信号,以期准确地确定起始分子的数量,虽然没有明确提出“数字PCR”的概念,但是已经建立了数字PC
3、R基本的实验流程,并且确定了数字PCR检测中一个极其重要的原则——以“终点信号的有或无”作为定量方法。这是数字PCR的雏形。1999年Vogelstein等[2]在检测粪便中进行癌变组织脱离细胞的BRAF特异突变型基因时,因受到体细胞基因的干扰,而碰到检测灵敏度和检测分辨率的瓶颈,而采用了在384孔板中对每个反应孔的样品量进行极限稀释并增加反应孔数进行检测的方式,从而提出了数字式PCR的概念,同时也提出如果采用更多孔板其检测灵敏度会更高,从而指出了数字PCR系统的发展方向。1数字PCR技术的原理阳性反应阳性目标分子阴性阴性反应(a)(b)(c)(d)图1数字PCR原
4、理示意图(a)样品,(b)样品被分成多个微小的反应单元,(c)PCR反应,(d)检测荧光计数图2微反应室/孔板数字PCR[10]10生物技术世界BIOTECHWORLD生物技术图3微流控芯片数字PCR[11,12]2定量分析方法数字PCR采用直接计数的方法进行定量分析,即在PCR扩增结束后有荧光信号的反应单元记为1,无荧光信号则记为0,有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子。理论上,在样品中目标DNA浓度极低的情况下,有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA分子的拷贝数。但是,在通常情况下,数字PCR的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子,这时需要采用
5、泊松概率分布公式(Poissondistribution)进行计算[3,4]。图4液滴数字PCR示意图[15]表1数字PCR应用实例kp(Xk)eZZ(k0,1,2,)(1)n!上式中λ为每个反应单元中所含目标DNA分子的平均拷贝数(浓度),p为在一定的λ条件下,每个反应单元中所含k个拷贝目标DNA分子的概率。λ由样品的稀释倍数m决定,有λ=cm,其中c为样品的原始拷贝数(浓度)。当k=0(不含目标DNA分子)时,上式可简化为p=e－λ=e－cm,p可以看作是无荧光信号的反应单元数与反应单元总数的比值,即nfecm(2)n其中,n为反应单元总数,f为有荧光信号的反应
6、单元数。上式两边取对数(ln)得到数字PCR一般包括两部分内容,即PCR扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段,数字PCR先将样品稀释到单分子水平,再平均分配到几十至几万个单元中进行反应。与qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法不同,数字PCR是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集,有荧光信号记为1,无荧光信号记为0,有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的。理论上,在样品中目标DNA浓度极低的情况下,有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA分子的拷贝数。但是,通常每反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子,就需要使用泊松概率分布函数(Poissondist
7、ribution)进行计算,根据反应单元总数、有荧光信号的单元数以及样品的稀释系数,就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。数字PCR的关键是稀释模板,通过将一个样本分成几十到几万份,分配到不同的反应单元,每个单元包含0个或一个(至多数个拷贝)的目标分子,在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行统计学分析。(如图1所示)fcmln(1)(3)n根据数字PCR反应单元总数和有荧光信号的单元数以及样品的稀释倍系数,就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。因为数字PCR通过终点检测计算目标序列的拷贝数,所以无需采用内参和标准曲线就可
