分子生物学常用技术原理.ppt

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1、１Geneticengineering重组DNA技术的发展史1865年　G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉分子生物学常用技术原理相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理重组DNA技术应用本节主要内容一、基因工程的基本概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合

2、。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)——利用基因克隆方法获取目的基因并使克隆的基因表达为蛋白质或多肽产物或定向改造细胞乃至生物个体的特征及相关的工作称基因工程，二、工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶多核甘酸激酶等重组DNA技术中常用

3、的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基

4、末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基（一）限制性核酸内切酶1、概念限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶2、限制性核酸内切酶命名Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切

5、口、粘端切口GGATCCCCTAGG3、限制性核酸内切酶的识别和切割位点分为I,和II类限制性内切酶.重组DNA主要用II类酶BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口（1）、产生5突出粘性末端，以EcoRI为例5GAATTC..33CTTAAG..55…GAATTC….33…CTTAAG…5(2)、产生3突出粘性末端，以Pst为例5’…CTGCAG3’…3’GACGTC…5’5’…CTGCAG…3’3’…GACGTC…5’(3)、产生平端：如前图作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限

6、制外源DNA，保护自身DNA。*分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）（二）、其它工具酶1、DNA连接酶2、DNA聚合酶、（1）、DNA聚合酶的性质；（2）、DNA聚合酶的主要用途3、逆转录酶4、多核苷酸激酶5、硷性磷酸酶6、末端脱氧核苷酸转移酶三、载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA粘粒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表

7、达载体。三、载体此处是标题wanghome表达载体载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。（一）、质粒(plasmid)特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）（二）.噬菌体(ph